豬卵母細胞體外成熟的研究進展

劉曉輝,郎洪彥,金海國,羅曉彤,劉 錚,王曉陽

(吉林省農業科學院 畜牧科學分院，吉林 公主嶺 136100)

豬卵母細胞體外成熟的研究進展

劉曉輝,郎洪彥,金海國,羅曉彤,劉 錚,王曉陽

(吉林省農業科學院 畜牧科學分院，吉林 公主嶺 136100)

綜述了豬卵母細胞體外成熟的分子機理和影響因素，以期為后續工作奠定基礎。

豬；卵母細胞；體外成熟

卵母細胞體外成熟(IVM)是隨著動物胚胎體外生產(IVP)技術的產生和發展而起來的。IVM是體外受精、核移植、轉基因等生物技術的重要環節，受到眾多因素的調控，其調控機制非常復雜。

盡管豬卵母細胞體外成熟技術至今已經取得了很大的進步，并已經建立了比較完善的體外成熟培養體系，但卵母細胞體外成熟的質量還不夠高，達不到大量生產體外胚胎的要求，還有待于進一步完善提高。

1 卵母細胞體外成熟的機理

卵母細胞體外成熟是指在體外特定的條件下，經過一系列生長發育最終形成有受精、胚胎發育能力的過程。卵母細胞的成熟包括細胞核的成熟和細胞質的成熟，核成熟先于質成熟。細胞核成熟包括：卵母細胞恢復減數分裂、細胞核膜破裂、核仁發生致密化、生發泡破裂(GVBD)并發育到第1次減數分裂中期；同時，卵母細胞進一步跨越第1次減數分裂中期，排出第1極體，并停止于第2次減數分裂的中期，直到受精、激活后才完成第2次減數分裂并排出第2極體。細胞質的成熟包括：細胞器的變化和細胞基質的變化。皮質顆粒在胞質合成后，逐漸遷移到質膜下的皮質區。高爾基復合體最初位于核的周圍，成熟過程中移向皮質，皮質顆粒完全形成后，高爾基復合體在皮質中消失。發育早期的線粒體為圓形或橢圓形，主要分布于皮質部，卵母細胞成熟后，線粒體又移向核周圍，形成幼稚型線粒體。隨著卵母細胞的成熟，粗面內質網減少，滑面內質網增多，到成熟晚期，滑面內質網變得很少。胞質成熟的特點就是積累一些穩定的mRNA，并在卵母細胞成熟的一定階段進行蛋白質的翻譯。并且，細胞質成熟與細胞核成熟中有些內容也是相互關聯的。有些細胞質成熟過程依賴于細胞核成熟。因此，只有當體外成熟和體內成熟非常接近的生活環境，才能獲得較高的成熟率。

核、質的成熟與卵丘細胞的成熟及其卵丘－卵母細胞復合體的發育成熟之間也存在著復雜的相互促進和相互抑制作用。體外培養實驗證明，從腔前卵泡來的卵母細胞剝去顆粒細胞或與散在的顆粒細胞共同培養，都不能進行明顯的生長[1]。這是由于卵母細胞的生長依賴于與它周圍的顆粒細胞之間的縫隙連接所介導的通訊，其生長速度與它周圍的顆粒細胞有關[2]。這些雖然被人們所了解，但機理還不是非常清楚，有待于進一步的探索，以使體外成熟效果與體內成熟的效果趨于一致。

2 影響卵母細胞體外成熟的因素

2.1 動物的種類、年齡及健康狀況

豬不同品種之間，其卵母細胞質量也存在差異，如瘦肉型豬與非瘦肉型豬，野豬與家豬，外國品種與國內品種。即便是國內不同省份的品種，也可能因遺傳背景、特定營養環境、氣候條件的不同，導致卵母細胞質量和體外成熟培養的差異。

同一豬種在不同年齡、個體其卵母細胞體外成熟的情況也有所不同。成年期的健康豬體其卵巢表面直徑3～6 mm卵泡比例較高，所抽取的卵母細胞胞質均勻、形態完好、裸卵較少，體外培養效果好。初情期前的青年母豬的卵巢卵母細胞體外成熟后可得到后代，但是效率不如成年母豬卵巢體外成熟的卵母細胞，即使是性成熟后還沒有懷孕經歷。而且，發情周期漸趨正常的青年母豬其卵母細胞在支持后期發育上也比初情期前的青年母豬好[3]。但是，Kuhholzer等體細胞核移植(SCNT)時經產母豬以及初情期前母豬卵母細胞對發育影響不大[4]。

2.2 卵母細胞的分級

包裹在卵母細胞周圍的卵丘細胞的層數也影響著卵母細胞的體外成熟。不同的研究者對卵母細胞的分類不盡一致。根據卵母細胞外卵丘細胞的有無和層數，豬卵丘-卵母細胞復合體分5級[5]。A級：擴展且顏色較暗，卵丘細胞有5層以上包裹的胞質均勻的卵母細胞；B級：卵丘細胞顏色較淺且稀疏的，卵丘細胞有5層以上包裹的胞質均勻的卵母細胞；C級：有3～5層卵丘細胞緊密包裹的均勻胞質卵母細胞；D級：卵丘細胞稀少，胞質不均勻；E級：裸卵、黑卵。A、B級可以用于體外成熟培養，一般成熟率較高，而C、D級則效果較差，E級不能用于體外培養。

2.3 卵巢運輸

卵巢一般都從離實驗室較遠的屠宰場獲得，要考慮卵巢保存的溫度和離體時間對卵母細胞成熟率的影響。Yang等系統進行了運輸溫度和儲存時間的比較，其結果表明，牛卵巢在24℃保存24 h后收集的卵母細胞體外受精后不影響其后期發育[6]。與其他哺乳動物相比,豬卵母細胞對溫度特別敏感,卵巢的回收溫度較高或較低,卵母細胞體外成熟培養效果極差甚至是退化。較合適的回收溫度是32～35℃。當卵巢回收溫度低于25℃,豬的卵母細胞將受到冷休克的打擊。當回收溫度為36～39℃、25～28℃、14～17℃時,豬體外受精的卵裂率分別為52.3%、49.8%和28.8%[7]。Pimprapar比較了把豬卵巢分別放于4℃、15℃、25℃和35℃保存0 h、3 h、6 h和9 h后IVM、IVF，發現在25～35℃保存6 h仍可以有效維持豬卵的發育能力，但是發育率比35℃保存3 h的低。

2.4 生長因子

生長因子對卵母細胞成熟的作用是正向的。發育卵泡中存在多種促生長因子及其受體，它們同時影響卵膜細胞和顆粒細胞的增殖和分化，并參與調節卵母細胞的成熟。顆粒細胞一旦開始增殖分化，就分泌大量的細胞因子,如表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子(TGF)、白細胞介素(IL)、神經生長因子(NGF)、干擾素-r(IFN-r)、抑制素和活化素等，這些因子對卵母細胞的生長起決定作用。在豬的卵母細胞體外成熟培養中，研究較多的就是表皮生長因子(EGF)。EGF是一種卵母細胞成熟的誘導劑，能促進COCs的體外成熟，在COCs上存在EGF受體，隨著卵泡的發育表達增強，排卵前達到高峰[8]。EGF能夠誘導豬[9]、牛[10]體外培養卵子的卵丘擴散，并促進核成熟。EGF能促進卵母細胞成熟過程中蛋白質的合成，提高卵母細胞質的成熟質量，添加EGF培養成熟的卵母細胞受精后的發育能力更強[11]。另有研究報道，EGF對豬雌性原核形成有促進作用，EGF不但能促進卵母細胞減數分裂，也間接調節卵母細胞漿的成熟。

2.5 卵母細胞成熟促進因子(MPF)

MPF是一種蛋白激酶，由調解亞基細胞周期蛋白CyclinB和催化亞基p34 cdc2兩種蛋白組成的復合體，它以非激活的前體物質存在于成熟前的卵母細胞中。Cdc2和CyclinB的變化直接影響到MPF的活性。p34cdc2在無分裂能力的卵母細胞中含量很低，體外成熟后含量則明顯提高，這表明卵母細胞成熟分裂能力的恢復與p34 cdc2的濃度有關。CyclinB隨著細胞周期的變化而周期性地產生，在分裂間期這種周期蛋白不斷積蓄，超過激活MPF的臨界值，在分裂后期這種蛋白降解造成MPF復合體的失活。MPF前體轉化為MPF需p34cdc2去磷酸化。而CyclinB不僅是MPF的調節亞基，而且還可以直接激活與MPF激活有關的cdc25酪氨酸磷酸酶。此外，CyclinB在激活MPF的同時還激活了p39mos，p39mos控制微管組織中心的變化，影響紡錘體的形成[12]。

2.6 卵泡液

卵泡液是卵母細胞體內發育的介質，含有大量來自血清的生化因子和卵母細胞及卵泡細胞的分泌因子，對卵母細胞成熟具有重要調節作用。主要表現在提高卵母細胞質成熟的質量，增強胚胎的發育能力[13]。Yoshida等檢測出豬卵泡液(pFF)中含有一種分子量介于1萬～20萬道爾頓的酸性基質,在成熟液中添加豬卵泡液顯著提高豬卵母細胞的核成熟率、正常受精率和卵裂率。因此，在卵母細胞的體外成熟培養中，都要添加一定比例的卵泡液，以促進卵母細胞胞質成熟。并且，在體外條件下，pFF能有效降低豬卵母細胞染色體異常的發生率，調解和加速極體排出，使核質成熟趨于同步化。但添加過高則抑制卵母細胞核成熟(Yoshida 等)，成熟液中添加10%pFF可促進豬卵母細胞在體外的核成熟。控制其濃度，一方面消除了對核成熟的抑制作用，另一方面又突出了對胞質成熟的促進作用。

2.7 卵母細胞成熟抑制因子(OMI)

OMI是指卵泡液中能夠抑制卵母細胞成熟的物質。OMI是一個多肽，分子量約為1～2 kDa,許多哺乳動物卵巢的卵泡液中均存在，并且在卵母細胞體外培養中可阻止自發減數分裂成熟。目前研究較多的成熟抑制因子有環核苷酸和嘌呤。在體外，通過抑制磷酸二酯酶活性阻止細胞內cAMP降解或是通過激活腺苷酸環化酶升高細胞內cAMP的試劑，都可以抑制卵母細胞的成熟。因此，卵母細胞中的cAMP是控制減數分裂阻滯的重要因子，同時它也能抑制GVBD的發生。有的研究表明,次黃嘌呤(hypoxanthine，HX)是卵泡液低分子量組分中能夠抑制卵母細胞成熟的主要成份。豬卵泡液中HX的濃度為1 141mmol/L[14]。HX在(1～6)mmol/L濃度內，能夠劑量依賴性地抑制豬裸卵母細胞的自發成熟[15]。HX對豬卵母細胞成熟的抑制作用，與卵母細胞內的cAMP的水平有關。已知cAMP可以抑制卵母細胞成熟，而HX可以抑制磷酸二酯酶(PDE)的活性,使卵母細胞內的cAMP處于高濃度狀態,從而抑制卵母細胞成熟[16]。

2.8 激素

激素是哺乳動物卵母細胞成熟的重要物質。目前,絕大多數研究者在卵母細胞的體外成熟培養過程中，添加促性腺激素或類固醇激素或兩者的混合物。但是，它們在卵母細胞體外成熟過程中的作用及作用機理尚未清楚。根據已有的研究結果推測，激素誘導卵母細胞恢復減數分裂可能通過2條途徑：①誘導卵丘擴散使顆粒細胞與卵母細胞的間隙連接中斷，使卵丘細胞的信息不能傳入卵母細胞，從而解除卵丘細胞對卵母細胞恢復減數分裂的抑制作用，重新啟動減數分裂。②誘導卵丘細胞產生一些刺激因子，克服抑制物質的作用而恢復減數分裂。現在，體外成熟培養中，主要以添加LH和hCG為主。Funashi等的研究表明,在豬卵母細胞體外成熟時,培養的前20h加入激素，培養20h后去掉激素,可增加卵母細胞體外成熟率,促進卵母細胞的減數分裂和細胞質成熟。同時指出,在豬卵母細胞體外成熟中,有兩個關鍵步驟是受激素調節的。一是核成熟,它可由培養的前20h加入激素所激發；二是細胞質成熟,在培養的后20h去掉一部分或全部激素可以促進細胞質的成熟[17]。DelosReyes[18]等的研究也發現,在豬卵母細胞體外培養的第2階段去掉激素可以提高卵母細胞的體外成熟率。

2.9 培養條件

不同動物體外成熟所需的濕度、溫度和氣相有所不同。不同動物的卵母細胞, 其最適培養溫度不同, 人和哺乳動物細胞最適的溫度為37℃。豬卵母細胞的體外成熟培養多采用38.5～39℃。對于氣相條件，體外培養的COCs所處的環境和體內生理環境大相徑庭，而卵母細胞為了更好的生存，必然會調動一些機制來適應體外培養的環境，導致負擔增加，也必然影響其最后的成熟。由于體內卵母細胞所處的環境氧濃度比空氣中的分壓低得多。所以，有人嘗試利用低氧分壓，在CO2培養箱中培養COCs，CO2濃度為5%。卵母細胞的核成熟受影響不明顯，但是體外受精以及孤雌激活胚都得到了很好的后期發育[19]。但是，也有人認為高氧時IVF胚發育較好。因此，有必要進行更深入的研究。

2.10 培養時間

哺乳動物卵母細胞體外成熟培養時間通常是22～24 h。但豬比較特殊，通常需要44～48 h左右能達到核成熟，24 h時的核成熟率幾乎為零。雖然延長培養時間可以使核成熟率逐步增高,但豬的卵母細胞會逐漸老化。因此，在保證一定的核成熟率的前提下，有必要縮短豬卵母細胞體外成熟培養時間。

3 結語

隨著豬體外受精(IVF)、核移植(NT)、轉基因等生物技術的迅速發展，對卵母細胞的要求越來越大，如何獲得大量高質量卵母細胞變得尤為重要。通過超數排卵技術來獲取體內成熟卵母細胞不僅數量有限且成本高昂，所以通過屠宰場獲取卵巢，抽取未成熟的卵母細胞，經體外成熟培養，不僅僅可以獲取大量的卵母細胞，還可以大大降低卵母細胞的成本。但經體外成熟的卵母細胞質量參差不齊，其質量的優劣和成熟率的高低直接影響胚胎后期的發育。要提高卵母細胞發育的潛力，還要依賴卵母細胞體外成熟(IVM)技術的進一步優化。

[1] Epping JJ. Mouse oocyte development in vitro with various culture systems. Dev Biol, 1997,60:371-388.

[2] Herlands RL, Schultz RM. Regulation of mouse oocyte growth Probable nrtritional role for inter-cellular communication between follicle cells and oocytes in oocytes growth .J Exp Zool,1984,229:317-325.

[3] Coy P, Romar R.. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reprod Fertil Dev,2002, 14:275-286.

[4] Kuhholzer B, Tao T, Machaty Z et al. Production of transgenic porcine blastocysts by nuclear transfer.Mol Reprod Dev, 2000, 56:145-148.

[5] 潘登科. 影響豬體細胞克隆胚胎發育能力因素研究:[博士學位論文].北京：中國農業大學.2005.

[6] Yang NS, Lu KH, Gordon I. In vitro fertilization(IVF) and culture (IVC) of bovine oocytes from stored ovaries. Theriogenogy, 1990, 33:352.

[7] 文國藝. 卵巢保存溫度對豬體外受精的影響[J]. 廣西農學報, 2000, (1) : 22-241.

[8] Einspanier R,Schonfelder M, Muller K,et al.Expression of the vascular endothelial growth factor and its receptors and effects of VEGF during in vitro maturation of bovine cumulus oocytes complex(COC).Mol Reprod Develop,2002,62(1):29-36.

[9] Wang W，Niwa K. Synergetic effects of EGF factor and gonadotropins on the cytoplasmic maturation of pig oocytes in a serum free medium[ J].Zygot,1995, (3):345-350.

[10] Coskun S，Lin YC .Mechanism of action of epidermal growth factor-induced porcine oocyte maturation [J].Mol. Reprod. Dev .1994a,(42):311-317.

[11] Abeydeera LR，Wang WH，Cantley TC，et al.Development and viability of pig oocytes matured in a protein-free medium containing epidermal growth factor[J].Theriogenology,2000,(54):787-797.

[12] Yoo J G，Lee H J，Choe S Y，et al. The use of cdc2 kinase inhibitor as a potent activator in recomstitued bovine embryos with primordial germ cells [J].Theriogenology, 2001,55:297.

[13] H.Khatir, P.Lonergan, C.Carolan, et al.Prepubertal bovine oocyte: A negative model for studying oocyte developmental competence.Mol.Reprod.Dev,1996, 45(2):231-239.

[14] Downs SM. Purine control of mouse oocyte maturation : evidence that nonmetabolized hypoxanthine maintains meiotic arrest. Mol Reprod Devol,1993 ,35 :82-94.

[15] Miyano T , Ebihara M , Goto Y, et al. Inhibitory action of hypoxanthine on meiotic resumption of denuded pig follicular oocytes in vitro. J Exp Zool,1995 ,273 :70-75.

[16] Downs SM , Coleman DL ,Ward - Bailey PF ,et al.Hypoxanthine is the principal inhibitor of murine oocyte maturation in a low molecular weight fraction of porcine follicular fluid.Proc Natl Acad Sci,U.S.A. 1985 ,82 :454-458.

[17] H Funahashi, TC antleyand, BN Day. Different hormonal requirement of pig oocyte cumulus complex esduring maturation in vitro[J].J Reprod Fert,1994,101:159-165.

[18] Delos Reyes M, Lapierre L, Saenz L, et al.Effect of the lenth of the hormonal supple mentation on in vitro maturation of porcine oocytes [J].Theriogenology, 2001, 55(1):468.

[19] Karja NW, Wongsrikeao P, Murakami M et al.Effects of oxygen tension on the development and quality of porcine in vitro fertilized embryos. Theriogenology, 2004, 62:1585-1595.

S828.3

B

1005-2739（2011）04-0007-05

2011-02-16

吉林省科技發展計劃項目《利用體細胞核移植技術生產轉基因豬的研究》（20080566）

劉曉輝(1974-),男，助理研究員，碩士。

王曉陽(1956-)，男，副研究員。