噬菌體展示肽庫技術及其在分子病原細菌學研究中的應用

趙紅蕾,刁昱文,馮 新,高 宇,劉珊珊,顧敬敏,雷連成,韓文瑜

(吉林大學畜牧獸醫學院,吉林長春,130062)

1 概 述

近年來,抗菌藥物耐藥性成為需要緊急采取行動的全球問題,迫切需要尋找能有效殺傷病原微生物,且不易形成耐藥性的新型抗微生物制劑或具有防御作用的新型疫苗。基于噬菌體展示技術的病原體抗原表位分析既是研究抗原分子的結構和功能、抗原—抗體反應機制的基礎,又可為多肽疫苗研制、藥物篩選以及特異血清學診斷方法的建立提供重要的線索和依據[1]。

噬菌體表面展示技術是Smith于 1985年首先建立起來的一種新的生物技術[2],它將外源基因插入絲狀噬菌體基因組中,從而使表達的外源肽或蛋白與噬菌體衣殼蛋白融合而展示在噬菌體表面,被展示的蛋白或肽可以維持相對穩定的空間結構和生物學活性[3,4]。1990年,Scott等[5]首次將隨機序列肽與絲狀噬菌體表面蛋白g融合展示在噬菌體表面,建立了噬菌體展示隨機肽庫。之后,噬菌體肽庫技術訊速發展,已廣泛用于抗原表位篩選、免疫學診斷、疫苗研制、藥物篩選等方面,尤其在蛋白質結構研究[6]、抗原表位分析[7]、人工抗體制備[8]、激素或病毒受體結合序列及酶的底物或抑制劑序列的確定、細胞因子拮抗劑的研制和尋找細胞內信號蛋白等研究中發揮重要作用[9]。筆者從噬菌體展示技術的基本原理、肽庫的構建、噬菌體肽庫的分類、噬菌體肽庫的篩選方法等方面,綜述了噬菌體展示肽庫技術;從抗原表位研究、免疫診斷研究、基因疫苗研究、抗菌藥物的靶向投遞等方面,闡述了噬菌體展示肽庫技術在分子病原細菌學中的應用;并對今后的研究方向進行了展望。

2 噬菌體展示肽庫技術

2.1 噬菌體展示技術的基本原理

噬菌體展示技術是將多肽或蛋白質的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體衣殼蛋白結構基因的適當位置,在閱讀框正確且不影響其衣殼蛋白正常功能的情況下,使外源多肽或蛋白與衣殼蛋白融合表達,融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結構和生物活性,以利于靶分子的識別和結合。肽庫與靶蛋白分子經過一定時間孵育后,洗去未結合的游離噬菌體及親和力較弱的噬菌體,然后以競爭性受體或酸性洗脫劑洗脫與靶分子強力吸附的噬菌體,洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經繁殖擴增,再進行下一輪洗脫。經過 3～5輪的“吸附—洗脫—擴增”后,與靶分子特異結合的噬菌體得到高度富集。而后通過測序分析可以得到多肽基序而用于下一步的疫苗研究、診斷元件構建或其它目的[10,11]。

2.2 肽庫的構建

噬菌體隨機肽庫是由上億種與噬菌體外殼蛋白以融合的形式呈現在噬菌體表面的多肽所組成,庫中上億種多肽分別呈現在上億個噬菌體表面,眾多重組型噬菌體便組成了噬菌體隨機肽庫。構建肽庫的關鍵是獲得足夠的獨立噬菌體克隆。以 6肽為例,至少應獲得 107～109以上的獨立克隆。肽庫的建立基于以下事實:(1)含有關鍵殘基的小肽可以模擬蛋白質上的結合位點(抗原決定簇);(2)蛋白質之間的相互作用及識別是通過局部肽片段的相互作用實現的。噬菌體肽庫技術是噬菌體展示技術同生物進化理論相結合的產物。

在噬菌體展示隨機多肽庫的構建策略中,大多數的肽庫是將隨機多肽片段與 pⅢ的N末端融合而展示于噬菌體表面,也有一部分肽庫采用pⅧ的N端展示。pⅢ允許展示較大的蛋白質,大至 50 ku的蛋白質己被成功展示,其在病毒顆粒上只含有少數幾個拷貝,因而對于獲得高親和力的多肽很有好處,故pⅢ幾乎是目前所有噬菌體展示庫的骨架。而pⅧ只能融合較小的外源肽段,攜帶肽段太大會影響噬菌體粒子的組裝與感染能力,但其拷貝數高,重組噬菌體作為免疫原時,可產生良好的免疫應答反應,在疫苗研制中應用價值大。

目前,肽庫的構建主要有兩種途徑:一是有機合成法,二是基因合成法。前者是直接用固相肽合成技術,合成含有各種可能序列的短肽。基因工程方法是將編碼各種序列特定長度短肽的目的基因克隆進表達載體,與噬菌體的外殼蛋白基因融合表達,使得一個噬菌體上含有一種序列的肽。目前使用的噬菌體載體大多是在pⅢ或 pⅧ基因區通過定點突變引入適宜的酶切克隆位點,同時在其下游插入抗生素抗性基因和包含復制起始位點的DNA片段構建而成。

2.3 噬菌體肽庫的分類

噬菌體肽庫依據外源融合多肽的構象是否被限制,可分為兩類:一類為展示于噬菌體表面的多肽,其構象不受限制,即沒有束縛其外源融合多肽構象的二硫鍵存在,呈線性狀態;另一類為構象限制的肽庫,其特點是外源隨機肽兩側各有一個 Cys殘基,在噬菌體表面形成二硫鍵,它與受體的親和力比線性肽庫要高。在篩選受體的相應配基時,使用構象限制性肽庫比使用完全隨機肽庫更容易獲得成功。另外,噬菌體肽庫依據展示于噬菌體外膜上外源融合多肽的拷貝多少形式的不同,可相應地分為單價多肽噬菌體庫和多價多肽噬菌體庫。目前,根據噬菌體載體的不同,噬菌體展示系統主要分為:絲狀噬菌體系統、λ噬菌體系統、T4噬菌體系統以及T7噬菌體系統。

2.4 噬菌體肽庫的篩選方法

目前,國內外文獻報道的噬菌體展示肽庫篩選方法有很多種,如:固相純化抗原篩選、液相篩選法(磁珠篩選)、全細胞篩選、動物體內篩選、血清篩選等。能否從肽庫中篩到特異性強的噬菌體克隆受到多個因素的影響,其中,篩選方法的合理應用在很大程度上起著決定性作用。

2.4.1 固相篩選法 固相純化抗原篩選最早的辦法是用抗原包被 ELISA板,方法與常規的ELISA方法相似,但抗原濃度要適當提高。近年來,不斷有文獻報道通過改進固相篩選方法取得了很好的效果[12,13]。

固相篩選法操作簡單,篩選出陽性克隆的幾率高,但需要純化大量的靶蛋白純品,而且不易根據抗體庫和抗原的性質進行量化處理,因而針對抗體的親和力有所選擇時此法效果欠佳。同時,固相篩選出的抗體有時不能與天然抗原結合,并且要求抗體庫的庫容量較大。

2.4.2 液相篩選法 液相篩選法將抗原用生物素標記后在液相中利用鏈親和素磁珠借助磁場的作用進行多肽噬菌體篩選。其優點是增加了噬菌體顆粒與抗原接觸的幾率,提高了篩選效率;篩選體系可以根據抗體庫的庫容、抗原的相對分子量和純度等對篩選體系進行調整;可預先確定所期望抗體的親和力,選擇性地篩選到不同親和力的噬菌體抗體[14]。但是液相篩選獲得的克隆特異性比較差。

2.4.3 體內篩選法 體內篩選方法將常規的噬菌體展示技術與動物荷瘤模型相結合,進行腫瘤或其內部血管上特定配體的篩選。體內噬菌體展示技術除了具備常規的噬菌體隨機肽庫快速、高效的特性外,還因為該篩選過程主要在動物體內進行,能夠充分模擬人體內環境,并最大程度地保持感興趣組織或細胞上各種配體的天然構象,可以較好地評價目標篩選物親和吸附的特異性及偶聯藥物后的臨床效果[15]。但是體內篩選的特異性較差,容易篩得與血管壁或成纖維細胞等其他非特異性的噬菌體。而且,體內篩選周期長、操作復雜,容易出現噬菌體序列的丟失。

2.4.4 全細胞篩選法 全細胞篩選可以獲得針對細胞膜表面分子的特異性多肽,而且細胞膜表面分子以天然狀態存在,應用此方法篩選更容易獲得有功能的小肽[16]。并且全細胞篩選具有簡單、高效的優點,在篩選過程中試驗條件可控性強、影響因素小,實驗結果重復性高,是最常用的方法。但是細胞表面的目的蛋白含量較低,蛋白成分復雜,篩選的難度很大。

不同的篩選方法各具優勢,在實際的篩選過程中,應當根據抗體庫的庫容、抗原的性質和純度、篩選的目的,合理地選擇篩選方法,從而獲得更有效的結果。

3 噬菌體展示肽庫技術在分子病原細菌學中的應用

近年來,噬菌體隨機肽庫技術不斷被改進和完善,在生命科學的眾多領域得到了廣泛應用,在分子病原細菌學方面的應用主要表現在抗原表位篩選[5,17]、免疫學診斷[18～20]、疫苗研制、藥物篩選及靶向投遞[16]等方面。

3.1 抗原表位研究

抗原表位是抗原分子中與抗體或致敏的淋巴細胞結合的部位,有線性表位和構象型表位兩種類型,線性表位的氨基酸序列在一級結構上是連續的,而構象型表位是由一級結構上不連續的氨基酸殘基經過肽鏈折疊而在空間聚集在一起形成的一定的空間結構。在完整蛋白質產生的抗血清中,抗構象型表位的抗體占 90%,只有 10%的抗線性表位抗體。

傳統的抗原表位分析主要是通過分析抗原經物理化學降解得到的片段或人工合成一系列來源于抗原的肽段與相關抗體的結合活性而得到,此方法成本高,必須首先確定蛋白質的氨基酸序列,才能合成相應的肽,而在實際研究中,許多蛋白質的序列并不清楚。此外,由于表位多數情況下為包含結合受體所必需的某些氨基酸不連續的空間構象,僅少數為一段連續的線性氨基酸殘基,因此線性的合成肽僅能模擬蛋白質的線性表位,無疑會丟失眾多的構象型表位信息。

噬菌體肽庫技術將抗體作為受體暴露于肽庫中篩選到能與特異性抗體相結合的重組噬菌體肽的序列,彌補了合成肽篩選的不足。噬菌體隨機肽庫技術研究分析抗體所識別的抗原表位具有以下優點:(1)噬菌體多肽易生產和分離,價廉;(2)噬菌體穩定且保存時間長;(3)可進一步改造以滿足不同的需要;(4)噬菌體具有免疫原性,因而作為疫苗免疫時無需佐劑;(5)提供了一種快速鑒定免疫優勢中和抗原決定簇的有效方法。

目前,以純化的單抗為靶標篩選抗原模擬表位的應用最廣泛也最為成熟,為在未知條件下分離病原體的表位,或作為診斷試劑提供了廣闊的應用前景。國外學者已成功地篩選到不連續的與原始抗原沒有同源性的乙肝病毒(HBV)[21]、丙肝病毒(HCV)[22]、人類免疫缺陷病毒(HIV)gp 120蛋白[23]的模擬表位序列,這些序列均具有很強的免疫原性,不需要添加任何佐劑,所激發的抗體既能識別模擬表位抗原也能識別原始抗原。這些模擬表位抗原可以避免完整抗原的毒性作用并可以避免產生不需要的非中和抗體。同時利用噬菌體隨機肽庫還可以模擬一些半抗原和不具有免疫原性的物質,從而研制一些模擬肽藥物,如對肺炎球菌等一些細菌疫苗的研制都從模擬肽入手獲得了一定突破[24]。郭奕陽等[25]借助基因工程手段獲取了含有McAb2相應表位的融合蛋白及預期表位缺失蛋白,并利用噬菌體肽庫篩選 McAb2結合的關鍵位點,進而對該結合位點是否與 FH和 Fba蛋白的結合位點相重疊進行了研究,為進一步探索 Fba蛋白在GAS致病機制中的作用,鑒定 McAb2的功能及制備表位肽疫苗奠定了基礎。李妍等[26]通過利用噬菌體隨機肽庫技術篩選出 THp主要保護性抗原UreaseB,Lpp20,Catalase的B細胞表位,從而初步建立了Hp主要保護性抗原 B細胞表位鑒定的研究平臺,為Hp表位疫苗的研制奠定了一定的理論基礎。

3.2 免疫診斷研究

感染性疾病患者血清中含有針對抗原的各種抗體,但只有在天然抗原是微生物或者是已被克隆表達的情況下才容易獲得純抗原來鑒定特異性的抗體,而利用噬菌體隨機肽庫技術篩選到的小肽分子可以和患者體內的抗體相結合,從而發現患者血清中的特異抗體,可由此用于快速、特異性地診斷疾病。

Nathan等[27]構建了 1個針對熱帶病原菌(類鼻疽桿菌屬)的人鼠嵌合抗體 Fab庫,并利用此庫篩選出針對蛋白酶的克隆,分析了其作為蛋白酶抑制劑的功能。體外實驗證明,純化的 Fab有抑制該蛋白酶的能力,并對致病性蛋白酶有專屬性。Saldarelli等[28]應用噬菌體展示技術建立了人源重組抗體庫,從中獲得 15株對B型葡萄病毒有特異性的重組ScFv抗體。其中 2株的編碼基因在重組中以二聚體形式表達,用該二聚體ScFv抗體成功地在草本植物,葡萄樹的組織中直接檢出了 B型葡萄病毒,該抗體被認為可有效代替 B型葡萄病毒的多克隆血清,建立新的 DAS ELISA試驗標準,用于常規診斷。

3.3 基因疫苗研究

運用肽庫的最大優點是不需要靶蛋白的任何結構,只需利用其抗體或受體來捕獲噬菌體肽庫中的小配體,并可大量繁殖,這為疫苗的設計生產提供了極大方便。利用噬菌體展示肽庫親和淘篩可以得到一些抗原的模擬表位,這些模擬抗原除了能模擬天然抗原的結構外,還具有一定的免疫原性,能像天然抗原一樣刺激機體免疫系統產生免疫反應,由它產生的抗體能與真正病原體上的天然表位反應,這有利于將發現的表位作為人工合成疫苗的一個組分,在疫苗設計方面有著廣泛的應用前景[29]。

非典型嗜血流感桿菌(NTHi)是導致兒童中耳炎和成人下呼吸道疾病的常見原因。到目前為止,尚無有效的疫苗來防治。NTHi的一個主要表面蛋白混合寡糖(LOS)是重要的毒力因子。LOS毒力很強,以致于在體內很難被控制,但是去毒的 LOS是不依賴于T細胞的小分子,而且在體內的免疫原弱。Hou等[30]將噬菌體展示 12肽庫與抗 NTHi LOS的兔抗體反應,以期得到模擬LOS抗原。結果表明,得到的合成肽使兔產生了一定的抗NTHi LOS能力。

3.4 抗菌藥物的靶向投遞

傳統的新藥開發,由于對蛋白質結構與功能關系不夠了解,只能通過大規模的定點突變和費時的單個目的蛋白的克隆表達純化與篩選來修飾現有蛋白。

隨著人類對細胞認識的不斷深入,人們更多從分子水平來闡述細胞間的作用機制[31]。已經明確,受體是細胞同外界聯系的通道,各種生物因子(包括某些藥物)都是通過同受體結合而產生相應的生物效應。而噬菌體展示肽技術只要以一定功能的靶分子為受體,在天然蛋白質或特定功能的框架分子噬菌體展示文庫中篩選配體,就可以簡便快速地獲得與靶分子具有強親和力和特異性的小肽或新型蛋白,可作為受體的激動劑或拮抗劑[32],分析其結構就可以合成相應的藥物,作為候選藥物或用于抗菌藥物的靶向投遞。

噬菌體隨機肽庫技術用于病原菌導向治療研究主要集中在 3個方面:①篩選病原菌抗原表位特異性結合肽,與藥物耦聯后用于病原菌的藥物靶向投遞和治療;②篩選與病原菌致病性相關蛋白的結合肽,為病原菌免疫診斷提供了一個有前途的方法;③篩選病原菌相關抗原表位和蛋白結合肽后與基因耦聯,用于藥基因疫苗設計和基因治療。

4 問題與展望

噬菌體肽庫對于連續、不連續的或非肽表位(即糖蛋白)都具有良好的篩選作用,是研究復雜生物系統有用的工具。通過篩選得到的生物活性肽是構建“生物導彈”的基礎,至今據報道建立在這種基礎上的腫瘤導向治療表現出高效性和高安全性,其在病原細菌學中的應用也越來越受國內外專家學者的關注。

當然需要指出的是,噬菌體的建庫過程仍然依賴于 DNA的轉化,因而實際存在的肽庫的多樣性是有限的。肽本身的單一性也限制了對于復雜蛋白質分子的研究。而且篩選到的具有高親和力的生物活性肽與抗微生物藥物結合必須以不改變兩者特異性為前提,在結合后也應以病原體抗原表位為靶標實現準確地導向殺傷。雖然這樣,我們仍然可以用隨機肽庫篩選出的新的配體成為基因或藥物傳遞治療的載體,為病原菌治療開辟一條新途徑。

總之,噬菌體肽庫是噬菌體展示技術在近些年來發展起來的重要分支,其具有高庫容、高效方便及靈活的篩選技術等特點,使其在許多方面如功能基因組學、藥物設計和尋找新配體等占有重要地位。隨著篩選靶標范圍的擴展及相應的更加完善的篩選方法的建立,噬菌體展示肽庫技術必將為生物技術領域的發展,尤其是病原菌方面的研究和應用帶來巨大的推動。

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(責任編輯:朱寶昌)