抗結核分枝桿菌感染的免疫機制

姚翠梅,孫長江,雷連城,韓文瑜

(吉林大學畜牧獸醫學院,吉林長春,130062)

據世界衛生組織(World Health Organization,WHO)統計,全世界約有 20億人感染結核分枝桿菌,每年約有 880萬新發病例,200萬人因結核病而死亡,每 15 s就會有一個死亡病例。并且,隨著社會人員流動,HIV感染者增多造成的交叉感染使我國的結核病感染率一直處于上升趨勢,已經成為造成全球人類死亡的主要傳染病類型[1,2]。雖然全球有 1/3的人口感染結核分支桿菌,但只有 10%發展成為肺結核[2]。近幾年由于耐多藥結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的出現,給結核病的治療又提出了一大難題。至今,全球預防結核病的疫苗只有卡介苗(BCG)一種,但是近來發現此種疫苗對于成人結核病的預防幾乎起不到作用,對于幼兒的預防也存在一定的危險性。因此,了解宿主的免疫系統及機體相關細胞與病原菌的相互作用機制非常重要,并且能對結核病的預防和治療提供一定的幫助。

1 非特異性免疫

1.1 巨噬細胞與結核分枝桿菌相互作用

巨噬細胞是由骨髓中分化成熟的單核細胞進入血液,然后隨血流隨機分布到全身多種組織器官分化成熟而來。巨噬細胞壽命長,具有較強的吞噬功能,是MTB的最主要的靶細胞。組織中的巨噬細胞可以吞噬多種病原微生物并處理衰老死亡的組織,其自身還能分泌多種細胞因子和其他炎性介質參與局部炎癥反應、發熱反應等。巨噬細胞可以通過氧依賴性和非氧依賴性殺菌系統發揮殺傷和消除病原菌的作用。此外,它還可以加工處理遞呈抗原,啟動特異性免疫應答以及抗腫瘤等作用。

巨噬細胞有兩種識別MTB的方式:①直接識別 巨噬細胞能通過其表面的激素樣受體直接識別侵入機體的 MTB。在這些受體中,Toll樣受體(Toll2like recep tor,TLR)在MTB中的作用受到廣泛關注,其中 TLR 2更重要。結核分枝桿菌19-kD脂蛋白能被 TLR2識別,持續刺激巨噬細胞能降低 IFN-γ誘導的 MHCⅡ類分子的表達[3]。最新研究表明,還存在TLR 2非依賴途徑[4]。②間接識別 巨噬細胞可以通過表達補體受體識別 MTB。Daniel等[5]研究發現,補體 C5缺失的小鼠由于活性氧的合成和遞送障礙,殺滅MTB的能力減弱。Rooyakkers等[6]發現,補體受體 3剔除的小鼠巨噬細胞對MTB的黏附和吞噬作用降低。

巨噬細胞是 MTB進入機體內首先侵入的細胞,是MTB感染過程中的主要靶細胞。巨噬細胞能通過自身凋亡等殺滅菌體。巨噬細胞系統的細胞毒素具有兩個系統:一個是氧依賴系統,在抗微生物效應中起決定性的作用;另一個是氧不依賴的系統,溶菌酶等屬于該系統產物,這個系統也參與殺微生物活性。巨噬細胞主要通過氧依賴系統殺傷侵入機體的 MTB,激活的巨噬細胞發生呼吸暴發,產生反應性氧中間產物(ROIs)和反應性氮中間產物(RNIs),釋放溶菌酶等活性蛋白質,這些物質有強的氧化作用和細胞毒作用,對MTB有強的殺傷作用。另外,巨噬細胞與病原菌作用后處于激活狀態的巨噬細胞可以通過病原菌與 TLR相互作用激活 caspase-8,誘導其自身凋亡,破壞 MTB的生存環境,殺滅入侵的MTB。

在特異性細胞免疫應答中,巨噬細胞可以作為免疫遞呈細胞,通過吞噬、攝取外來抗原經過胞內酶將其降解為抗原多肽,在其內與內質網運來的MHCⅡ類分子結合,形成抗原肽與MHCⅡ類分子的復合物,然后被高爾基體運送至抗原遞呈細胞表面,供CD 4+TH細胞識別,刺激機體做出保護性應答。

MTB能在巨噬細胞內定居存活以及引起機體一系列的病理反應是與其免疫逃逸的機制分不開的。MTB進入巨噬細胞胞膜內化形成吞噬小體,然后與溶酶體結合形成吞噬溶酶體,溶酶體分泌的胞內酶可以促使吞噬溶酶體酸化,外源性抗原在吞噬溶酶體的酸性環境中被水解為抗原多肽。而MTB之所以能夠在巨噬細胞內存活是因為它能夠阻止吞噬溶酶體的酸化。MTB可以通過降低磷脂酶D的活性,下調MHCⅡ的表達,抑制吞噬溶酶體的成熟進而抑制巨噬細胞的氧依賴殺傷作用。Auricchio等[7]研究發現,CpG寡脫氧核苷酸可通過增強磷酯酶D的活性,增強巨噬細胞對 MTB的反應,恢復巨噬細胞的天然防御機制。

復旦大學免疫生物所[8]曾用不同劑量的熱滅活結核分枝桿菌H 37Rv(0,5,50,150,500mg/L)刺激BMDM 24 h后,再給予 IFN-γ(20μg/L)刺激 24 h,發現給予結核分枝桿菌刺激后,IFN-γ誘導的 MHCⅡ類分子表達降低,且呈劑量依賴性。如果持續刺激 TLR,機體會產生負調控,抑制過強的炎癥反應,如出現內毒素耐受等。結核分枝桿菌在機體內能長期存在,可能就是通過這種負調控機制,抑制IFN-γ誘導的巨噬細胞抗原呈遞功能,降低適應性免疫應答,從而產生免疫逃逸。

1.2 γδT細胞與結核分枝桿菌的相互作用

結核分枝桿菌侵入機體后首先遇到非特異性免疫機能的抵抗,其中以巨噬細胞吞噬和炎癥反應為主。對于 MTB主要參與非特異性免疫的細胞除了巨噬細胞,還有γδT細胞。

T淋巴細胞根據其表面抗原識別受體類型不同,分為包含 α,β鏈的 αβT細胞和包含 γ,δ鏈的 γδT細胞。 γδT細胞占外周血 T細胞的 0.5%～10%,主要分布在一些器官與外界相通處,如肺、上皮、黏膜免疫系統等。它對靶細胞的作用無專一性,無MHC限制性。

陳勇等[9]通過對結核桿菌耐熱多肽抗原MTB-Ag的蛋白組成進行定性分析,并觀察了MTB-Ag及其純化組分刺激人外周血 γδT細胞和 αβT細胞增殖反應的量效關系。得出如果有合適刺激劑量的MTB-Ag刺激,其所含的低分子多肽抗原能特異性激活 γδT細胞,而其所含的大分子蛋白抗原則特異性激活 αβT細胞。Hoft等[10]通過流式細胞計數儀發現,卡介苗接種組與非致敏的對照組相比,人類 γδT細胞明顯增多,并且以 γ9+δ2+T細胞為主。γ9+δ2+T細胞可以通過顆粒依賴性機制削弱胞內桿菌的生存能力,殺死寄存 MTB的巨噬細胞。在殺死被感染的巨噬細胞及 MTB時,穿孔素起了重要作用。

1.3 樹突狀細胞

樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞,他能高效的攝取、加工處理和遞呈抗原,未成熟 DC具有很強的遷移能力,成熟的DC能有效的激活初始型T細胞,處于啟動、調控、并維持免疫應答的中心環節。樹突狀細胞盡管數量不足外周單個核細胞的 1%,但表面具有豐富的抗原遞呈分子(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)、共刺激因子(CD 80/B7-1,CD 86/B 7-1,CD40,CD 40L等)和粘附因子(ICAM-1,ICAM-2,ICAM-3,LFA-1,LFA-3等),是功能強大的專制抗原遞呈細胞。DC具有免疫刺激能力,是目前發現的能激活未致敏的初始型T細胞的抗原遞呈細胞。

目前,分支桿菌肉芽腫中存在的DCs越來越受到關注。其中單核細胞衍生的 DCs是主要的單核細胞亞群,這個譜系中的細胞表面趨化因子受體主要包括CCR2,CCR 5及CCR6。研究發現,CCR 2高表達的小鼠可以加速免疫應答過程,而 CCR 2缺失的小鼠對于高劑量的結核分支桿菌(2×105CFU)易感,而對于低劑量的結核分枝桿菌(50～100 CFU)有一定的耐受性,延遲感染速度[11]。CCR 5缺失的小鼠在肺部引流淋巴結處發現相對較多的 DCs,說明 CCR 5的表達有助于保留DCs在肉芽腫區。表達CCR 7,CCR 8受體的單核細胞能促使分支桿菌由受損組織到引流淋巴結遷移。分支桿菌的吞噬體與機體生物合成途徑也受到DCs的控制,并且能夠阻止結核分支桿菌生長必須的營養的吸收[12,13]。這些研究表明,DCs在多種趨化因子存在時,可以移行到或者移行出肉芽腫。DCs對于感染細菌從受損組織或者肉芽腫區抗原移行到引流淋巴結,以便保持連續的T細胞引發反應方面起著關鍵作用。

2 特異性免疫

MTB作為一種胞內寄生菌,機體主要通過細胞免疫將其殺滅清除。首先抗原遞呈細胞的對抗原的遞呈,經過致敏階段、反應階段、T細胞分化為效應淋巴細胞并產生細胞因子,從而發生免疫效應。

TH細胞根據所產生細胞因子的不同分化為不同的Th細胞亞群。IL-2與IL-2R結合是促進T細胞增殖的一個條件。成熟的 Th0在 IL-12作用下分化為 Th1細胞,在 IL-4作用下分化為 Th2細胞。Th1細胞分泌 IFN-γ,IL-12,TNF-α等細胞因子參與細胞免疫應答,其中IFN-γ能有效激活巨噬細胞,促巨噬細胞殺滅進入細胞內的病原菌。誘導 M f高表達B7和MHCⅡ類分子,促進抗原的加工和提呈。促進 CTL分化,輔助 B細胞產生調理性抗體。Th2細胞分泌 IL-4,IL-5,IL-13參與免疫應答,主要功能為促進B細胞發育和介導體液免疫應答。在Th1細胞輔助下(或以非 Th1細胞依賴方式),初始CD8+T細胞分化成 CTL(活化的 CTL)。效應 CTL分泌穿孔素(perforin)和粒酶(granzyme),穿孔素在靶細胞膜上形成孔道,使細胞裂解。顆粒酶通過孔道進入細胞,激活凋亡相關酶系統介導靶細胞凋亡。效應 CTL表達 FasL,分泌 TNF-α,TNF-β,激活caspase信號轉導途徑,誘導靶細胞凋亡。目前認為 Th1細胞產生的細胞因子對于宿主抵抗 MTB的感染起主要作用,Th2細胞的作用還備受爭議[14～17]。

劉來成等[18]用 H 37Ra免疫小鼠,活化T細胞增殖,刺激產生高水平的 Th1型細胞因子 IFN-γ,Th2型細胞因子 IL-4的水平也高于生理鹽水對照組,但IFN-γ升高較 IL-4更明顯,說明H 37Ra免疫小鼠后在體內誘導的特異性免疫反應以Th1型為主。特別是細胞因子IFN-γ的參與,充分的證據表明,不同的 T細胞群包括 CD4+,CD 8+T細胞等都有參與到抵制 MTB的保護性免疫應答中[19]。胥萍等[20]通過流式細胞技術分析了初診肺結核患者外周血中 CD 4+T淋巴細胞及其亞型Th1和 Th2細胞亞型的改變,以便對結核病變過程的研究提供一定的標準。結果發現,初診肺結核 Th1細胞含量低于健康對照組、粟粒型肺結核Th1細胞含量顯著低于浸潤性肺結核。相反,與健康對照組相比,Th2細胞亞群卻有顯著升高。

另外,MTB侵入機體后,對 Treg及 Th17的研究發現,Treg和 Th17在針對 MTB的細胞免疫中有相反作用[21]。Treg抑制 Th1,Th2的免疫反應,可以通過產生腫瘤生長因子(Tumour growth factor,TGF)β,抑制 Th17的出現。TGF-β能通過緩沖促炎癥反應,保護機體組織免受損傷,對于持續受MTB刺激的組織,降低了機體對 MTB的應答,而 Th17有強烈的前炎癥反應。減少 Treg和增加Th17能夠通過刺激機體細胞免疫應答而增加機體的保護作用。

Manuela Grassi等[22]通過對人肺泡中 847個基因的分析發現,當機體感染 MTB后,IFN-γ以及與控制 IFN-γ產生的相關基因都有增量調節,還有部分促使細胞凋亡的基因也呈現不同程度的調節。另外一部分趨化因子象IL-8,MIP-1β,MIP-1α,MCP-1以及 GM-CSF-R在 60%結核病人體內也都發現有增量調節[23,24]。

MTB的抗原性物質分別經MHCⅡ類和MHCⅠ類分子途徑激活機體的CD4+TH細胞和CD 8+TCL細胞,分別識別外源性抗原和內源性抗原。CD4+TH細胞和CD 8+TCL細胞在抵抗 MTB感染中均發揮著重要作用?；罨?CD 4+TH細胞產生 IFN-γ和 IL-2等細胞因子,其中 IFN-γ可充分活化巨噬細胞,促其殺傷胞內吞噬的 MTB。CD 8+TCL細胞通過識別靶細胞,釋放穿孔素或顆粒溶素(Granu lysin)等誘導細胞溶解凋亡,破壞 MTB生長環境,使新增抗原遞呈而起到免疫監視的作用。另外,CD 8+TCL細胞也能夠分泌 IFN-γ。IFN-γ盡管在抵抗 MTB感染中不是唯一的因素,但卻是一個很關鍵的因素。IFN-γ的產生需要細胞因子 IL-12的刺激,而 IL-12是有樹突狀細胞在 MTB與 TLR作用后產生[25]。這也在單核巨噬細胞和 T細胞之間提供了一個橋梁紐帶的作用[26]。

3 結 語

機體對于抵抗 MTB感染的免疫機制是一個復雜而精密的過程,他不僅需要各種免疫細胞的參與,還需要各種細胞因子的刺激作用。各種免疫細胞之間不是孤立的起作用而是相互聯系在一起,如何控制機體向有利于清除MTB和增強機體免疫作用的方向發展將是今后研究結核病預防與治療的重點。隨著分子生物學、細胞生物學及免疫學的發展,對抵抗 MTB感染的免疫機制的揭示將會更加清晰,進而對于結核病的預防和治療也會提供很大的幫助,結核病的攻克也將不是難題。

[1] CORBET E L,WATT C J,WALKER N,et al.The growing burden of tuberculosis:global trends and interactions with the H IV epidem ic[J].Arch Intern Med,2003,163(9):1 009-1 021.

[2] World Health Organization.WHO report 2008:global tuberculosis control-surveillance,planning,financing[R].Geneva:World Health Organization,2008.

[3] MEGHAN E P,RISH K P,DAVID C S,etal.Mycobacterium tuberculosis 19-kDa lipoprotein inhibits IFN-γ-induced chromatin remodeling of MHC2TA by TLR 2and MAPK signaling[J].JImmunol,2006,176(8):4 323-4 330.

[4] LAFUSE W P,ALVAREZG R,CURRY H M,et al.Mycobacterium tubercu losis and Mycobacterium avium inhibit IFN-gamma-induced gene exp ression by TLR2-dependent and independent pathways[J].J Interferon Cytokine Res,2006,26(8):548-561.

[5] DANIEL D S,DAIG,SINGH CR,etal.The reduced bactericidal function of comp lement C52deficientmurine macrophages is associated with defects in the synthesis and delivery of reactive oxygen radicals tomycobacteria phagosomes[J].J Immunol,2006,177(7):4 688-4 698.

[6] ROOYAKKERS AW,STOKESRW.Absence of complement receptor 3 results in reduced binding and ingestion ofMycobacterium tubercu losis but has no significant effecton the induction of reactive oxygen and nitrogen intermediates or on the survival of the bacteria in resident and interferon-gamma activated macrophages[J].Microb Pathog,2005,39(3):57-67.

[7] AURICCHIOG,GARG SK,MARTINOA,etal.Roleofmacro-phage phospholipase D in naturaland CpG-induced antimy-cobacterial activity[J].Cell Microbiol,2003,5(12):913-920.

[8] 王翠妮,徐薇,熊思東.結核分枝桿菌對巨噬細胞抗原呈遞功能的抑制作用[J].微生物與感染,2009,4(3):132-136,184.

[9] 陳勇,呂合作,胡建國,等.刺激人 γδ+T細胞增殖的結核桿菌多肽抗原的純化與活性鑒定[J].細胞與分子免疫學雜志,2003,19(1):86-89.

[10] HOFTD F,BROWN R M,ROODMAN ST.Bacille Calmette-Guerin vaccination enhances human gamma delta T cell Responsiveness tomycobacteria sug-gestive of amemory-Like phenotype[J].JImmunol,1998,161(2):1 045-1 054.

[11] SCHREIBER O,STEINWEDE K,DING N,et al.Mice that overexp ress CC chemokine ligand 2 in their lungs show increased protective immunity to infection with Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin[J].J Infect Dis,2008,198:1 044-1 054.

[12] MOHAGHEGHPOUR N,VOLLENHOVEN A V,GOODMAN J,et al.Interaction of Mycobacterium avium with human monocytederived dendritic cells[J].In fect Immun,2000,68:5 824-5 829.

[13] TAILLEUX L,NEYROLLESO,BOUAKINE SH,etal.Constrained intracellul ar survival ofMycobacterium tuberculosisin human dendritic cells[J].J Immunol,2003,170:1 939-1 948.

[14] KAUFMANN SH.Is the developmentof a new tuberculosis vaccine possible[J].NatMed,2000,6(9):955-960.

[15] LAICK,HO S,CHAN CH,etal.Cytokine geneexpression profile of circulating CD 4+T cells in active pulmonary tuberculosis[J].Chest,1997,111:606-611.

[16] LINY,ZHANGM,HOFMAN FM,etal.Absenceof a p rominent Th2 cytokine response in human tuberculosis[J].Infect Immun,1996,16:1 351-1 356.

[17] SANCHEZ F O,RODRIGUEZ J I,AGUDELO G,et al.Immune res-ponsiveness and lymphokine production in patients with tubercu losis and healthy controls[J].Infect Immun,1994,62:5 673-5 678.

[18] 劉來成,王淑玲,范雄林,等.結核菌H 37Ra在小鼠體內誘導的免疫應答[J].中國生物制品學雜志,2008,21(5):391-394.

[19] REECE S T,KAUFMANN SH.Rational design of vaccines against tuberculosis directed by basic Immunology[J].International Journal ofMedicalMicrobiology,2008,298:143-150.

[20] 胥萍,施美華,費曉峰,等.肺結核患者外周血中Th細胞極化偏移及臨床意義分析[J].中國免疫學雜志,2010,26(2):178-181,185.

[21] CREVEL R V,OTTENHOFF T H,VANDERMEER JW.Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis[J].Clinical Microbiology Reviews,2002,15:294-309.

[22] GRASSIM,BOCCHINOM,MARRUCHELLA A,et al.Transcriptional profile of the immune response in the lungs of patients with active tuberculosis[J].Clinical Immunology,2006,121:100-107.

[23] MA X,CHOW JM,GRIG,etal.The interleukin 12 p40 gene promoter is primed by interferon gamma inmonocytic cells[J].J Exp Med,1996,183:147-157.

[24] SADEK M I,SADA E,TOSSIZ,et al.Chemokines induced by infection ofmononuclear phagocyteswithmycobacteria and present in the lung alveoliduring active pulmonary tuberculosis[J].Am JRespir Cell Mol Biol,1998,19(3):513-521.

[25] HOSHINO Y,TSE D B,ROCHFORD G,et al.Mycobacterium tuberculosis-induced CXCR 4 and chemokine expression leads to preferential X 4 HIV-1 rep lication in human macrophages[J].JImmunol,2004,172:6 251-6 258.

[26] SURCEL H M,BLOMBERG TM,PAULIES,et al.Th1/Th2 profiles in tuberculosis,based on the proliferation and cytokine response of blood lymphocytes tomycobacterial antigens[J].Immunology,1994,81:171-176.

(責任編輯:朱寶昌)