大腸桿菌卷曲菌毛及其致病性

邢艷蘋,王 瑜,楊 峰,雷連成

(吉林大學畜牧獸醫(yī)學院,吉林長春,130062)

以往認為埃希菌屬、沙門菌屬等腸桿科細菌表面的菌毛功能主要與細菌黏附及侵襲力有關(guān),其本身的組成成份與其致病性無直接關(guān)系。近 10余年的研究發(fā)現(xiàn),埃希菌屬卷曲菌毛的成分與臨床上的膿毒癥(sepsis)、敗血癥(septicemia)、感染性休克(septic shock)、全身炎癥反應綜合征(Systemic In flammatory Response Syndrome,SIRS)等一系列由革蘭陰性桿菌引起的嚴重感染性病癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有關(guān)。

1 大腸桿菌卷曲菌毛及其編碼基因

大腸桿菌卷曲菌毛(curli)是存在于大腸桿菌表面的一種異聚蛋白絲狀附屬物,直徑 4～7 nm,長度不等[1],富含保守的 β-折疊,每個 β-折疊按平行于卷曲菌毛軸線的方向相互疊加,而 β-折疊自身垂直于菌毛軸線[2]。卷曲菌毛結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定,理化抵抗力較強,能抵抗蛋白酶消化和去污劑降解;在 10 g/L的 SDS溶液中煮沸不溶解,在體積分數(shù)為 0.90的甲酸中才能解聚[3～5]。

大腸桿菌卷曲菌毛由操縱子基因 csg(curli subunit genes)編碼和轉(zhuǎn)錄。csg包括csgBA(C)和 csgDEFG等 2個操縱子[6～9]。前者由 csgB,csgA構(gòu)成,后者由 csgD,csgE,csgF和 csgG構(gòu)成。csgC目前尚不清楚是否存在,為假定基因(putative gene)[8],因為既沒有發(fā)現(xiàn)csgC的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,也沒有csgC在卷曲菌毛生物合成中具體作用的相關(guān)報道。在后續(xù)研究中,統(tǒng)一使用csgBA表示 csgBA(C)。2個操縱子向相反方向轉(zhuǎn)錄,其中 csgB和 csgD之間還有 521堿基對的間隔序列[10]。除csgD外,其他基因前都有一段編碼跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)位信號肽的序列[11]。2個操縱子在大腸桿菌株系間非常保守。

Dyer等通過 PCR檢測,發(fā)現(xiàn)所有被測的大腸桿菌無論能否表達卷曲菌毛,都可以檢測到 csgA和 csgD[12]。許多具有卷曲菌毛編碼基因的大腸桿菌并不表達和產(chǎn)生卷曲菌毛,其卷曲菌毛表達與否受到復雜因素的影響[13]。

2 大腸桿菌卷曲菌毛的致病作用

2.1 卷曲菌毛的黏附能力

卷曲菌毛的黏附性很強,能結(jié)合許多生物體表面物質(zhì),包括纖黏蛋白、層黏連蛋白、纖溶酶原、接觸時相蛋白、Ⅰ型主要組織相容性復合體等[14]。體內(nèi)外試驗表明,產(chǎn)生卷曲菌毛的細菌致病力比不產(chǎn)生卷曲菌毛的細菌更強,包括黏附、定植和侵襲宿主細胞的能力。

大腸桿菌可以在哺乳動物宿主體內(nèi)產(chǎn)生卷曲菌毛[15]。卷曲菌毛增強禽大腸桿菌的定植和存活能力,相同菌株的卷曲菌毛表達如果受到抑制,其存活能力下降[16]。Gophna等證明,與不能產(chǎn)生卷曲菌毛的大腸桿菌O 157∶H 7相比,能產(chǎn)生卷曲菌毛的大腸桿菌侵襲 HEp-2細胞的能力更強[17]。Uhlich等通過給小鼠灌服大腸桿菌O 157∶H 7(ATCC43895)發(fā)現(xiàn),與不產(chǎn)生卷曲菌毛的變異株相比,產(chǎn)生卷曲菌毛的變異株致死小鼠的時間更短[18]。

2.2 卷曲菌毛與淀粉樣蛋白

生物化學、生物物理學和圖像分析研究表明,大腸桿菌卷曲菌毛是淀粉樣蛋白(amyloid)[19]。近年來,淀粉樣蛋白被認為是一些疾病發(fā)生的標志,如阿爾茨海默癥、帕金森癥、Ⅱ型糖尿病、全身性淀粉樣變性和朊蛋白相關(guān)疾病[20]。

某些株系的大腸桿菌可產(chǎn)生淀粉樣蛋白,極類似于阿爾茨海默癥在腦中堆積形成的沉淀斑 。Virchow于 1854年首次用淀粉樣蛋白描述在給病變腦組織染色時觀察到的這種沉淀,這種沉淀能和碘強烈結(jié)合[22]。淀粉樣蛋白還可以結(jié)合剛果紅染料、硫代黃素 T抵抗蛋白酶消化和去污劑降解[23]。

是否因為細菌感染使這些淀粉樣蛋白形成于腦部便出現(xiàn)了阿爾茨海默癥?如果是細菌感染促使可溶性蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸蹣拥鞍?可以推測以下 2種原因:①直接通過細菌產(chǎn)生的淀粉樣蛋白致病;②間接促使體細胞生成的淀粉樣蛋白前體形成沉淀。因此,可以將大腸桿菌作為一個很好的研究淀粉樣蛋白沉積斑形成的模型系統(tǒng),深入研究可溶性蛋白轉(zhuǎn)變成淀粉樣蛋白的分子機制,進而預防和治療淀粉樣蛋白相關(guān)疾病[24]。

2.3 卷曲菌毛與生物膜

Kanamaru等發(fā)現(xiàn),從前列腺炎病人尿道分離的大腸桿菌,其卷曲菌毛的表達和生物膜(biofilm)形成密切相關(guān)[25]。生物膜是一種附著于有生命或無生命物質(zhì)表面的被菌外基質(zhì)包裹的有組織的細菌群體[26]。卷曲菌毛促進大腸桿菌在無生命物質(zhì)表面,如玻璃、特富龍(Telflon)、聚丙烯、聚氯乙烯等物質(zhì)表面形成生物膜[27]。卷曲菌毛相互纏結(jié),把鄰近的細菌聯(lián)結(jié)成小群落,逐漸發(fā)育為生物膜。

生物膜結(jié)構(gòu)復雜,外形似“基座”狀,內(nèi)部有通水的孔道。大腸桿菌成熟生物膜中包含細菌表面蛋白、卷曲菌毛、菌外基質(zhì)。菌外基質(zhì)是一種復雜的含水環(huán)境,包含蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA和離子等。其中多糖的成分差異很大,主要是纖維素,還有 β-1,6-N-乙酰-D-葡糖胺聚合體、喬拉尼奇酸(colanic acid)、藻酸鹽等成分[28]。

與游離狀態(tài)的細菌相比,生物膜中的細菌的生理機能和新陳代謝水平不同程度降低,以抵御外界不良環(huán)境因素帶來的各種影響[29]。大腸桿菌形成生物膜后,對消毒劑、殺菌劑的抵抗力增強;同時,生物膜中的細菌對抗生素的敏感性也降低,使療程延長[30]。

2.4 卷曲菌毛蛋白與膿毒癥

臨床上,細菌感染引起的感染性休克、敗血癥、膿毒癥(sepsis)及全身炎癥反應綜合征(sins)是導致危重病人死亡的主要原因之一 ,這其中又以革蘭陰性菌特別是腸桿菌科細菌中的大腸桿菌所占比例為大。以往認為,革蘭陰性菌引起敗血癥、膿毒癥、感染性休克的物質(zhì)主要是細菌的菌體成分如脂多糖/內(nèi)毒素(1ipopolyrsacc hande,LPS/endotoxi),而菌毛的作用主要表現(xiàn)在對宿主細胞的黏附方面。但近年來的研究結(jié)果表明,腸桿菌科細菌表面的curli菌毛的成份cs和CsgB也與敗血癥、膿毒癥、感染性休克的發(fā)病及病情轉(zhuǎn)歸有很大關(guān)系。已有報道用大腸桿菌 MC 4100株(野生型表達curli菌毛的大腸桿菌)、MHR 261株(cs變株,可分泌 Cs蛋白,但不形成 curli菌毛)、MHR 204株(csgA突變株,不表達 Cs蛋白)及 MHR 222株(csgA及 csgS雙突變株、CsgA及CsgB蛋白均不表達)做體外和體內(nèi)實驗,能表達Cs亞單位蛋白的MC4100株組和 MHR 261株組較其余兩株組誘發(fā)炎癥相關(guān)細胞因子(如TNF-Ot,IL-6,IL-1等)的水平顯著要高,而且也能激活一氧化氮(nitric oxide,NO),2型一氧化氮激酶(typenitric oxde snthase,NO S2)系統(tǒng)引起血管平滑肌釋放 NO;導致血管平滑肌舒張、血壓下降、心動過速和體溫降低等癥狀。這些實驗結(jié)果均提示curli菌毛的 Cs與 CsgB蛋白在此類感染性疾病的轉(zhuǎn)歸中與 LPS共同起著重要作用。

3 卷曲菌毛致病的相關(guān)因素

3.1 相關(guān)配體

作為細菌菌毛的一種,curb菌毛也在細菌的黏附過程中發(fā)揮著重要的作用。curli菌毛上的相關(guān)配體與相對應的分子結(jié)合,介導細菌黏附并進入真核細胞內(nèi)。curli上存在著層黏連蛋白、纖溶酶原、組織型纖維蛋白溶酶原、MHC I類分子、血纖維蛋白原的對應配體,能通過與纖維結(jié)合素作用介導細菌粘附、侵入真核細胞的過程[30]。

3.2 NO和NOS2

在膿毒癥、感染性休克的病人血清中,正常量的NO對于機體抵抗感染性病菌入侵是必要的,但NO水平的過度升高能導致患者血管平滑肌舒張,從而引起患者出現(xiàn)血壓降低、心動過速和體溫降低等癥狀,NO通過 NOS2引起的低血壓是感染性休克病人致死的一個主要原因。最近的實驗結(jié)果表明,不管在動物實驗或體外血管平滑肌培養(yǎng)實驗中,用不同菌株分別感染實驗小鼠或組織培養(yǎng)液內(nèi)后,能表達 CsgA和 Cs蛋白菌株組的小鼠血清內(nèi)和血管平滑肌體外培養(yǎng)液內(nèi) NO水平較 csgA或cs或csgB基因缺失菌株組的小鼠血清和血管平滑肌體外培養(yǎng)液內(nèi)的NO水平明顯為高。而實驗中所用菌量所含 LPS(以往認為引 N水平升高的主要物質(zhì))的量遠不能刺激機體或組織細胞產(chǎn)生如此高濃度的N 0[31]。

3.3 炎癥相關(guān)因子

在膿毒癥、感染性休克、SIRS所致?lián)p害里,真正由革蘭陰性菌菌體物質(zhì)直接導致的損傷是很小的。病人機體的損害主要是由細菌進入機體后引起機體自身產(chǎn)生的高水平炎癥相關(guān)分子,故臨床上病人血清中TNF-ot及 IL-6水平的升高常被作為膿毒癥、感染性休克、SIRS發(fā)生中細胞因子級聯(lián)反應的啟動及其嚴重程度的標志。相關(guān)的實驗結(jié)果顯示,用大腸桿菌 MC 4 100株、MHR 261株、MHR 204株以及 MHR 222株分別感染刺激人巨噬細胞 5～6 h后,能表達 CsgA蛋白的MC 4 100株和 MHR 261株組誘導巨噬細胞產(chǎn)生 NF-ot,IL-6和 II-8的量顯著高于不能表達 CsgA蛋白的 MHR 222株和MHR 204株組,表明 CsgA蛋白在刺激炎癥相關(guān)細胞因子分泌中起著重要的作用。

4 結(jié)論與展望

隨著研究的不斷深入,對于大腸桿菌卷曲菌毛的認識也在不斷加深。在體內(nèi),大腸桿菌卷曲菌毛侵入真核細胞可以躲避宿主的免疫監(jiān)測,并可以作為儲存器導致再次感染。產(chǎn)生卷曲菌毛的大腸桿菌的急性感染可以導致膿毒血癥,慢性感染可以導致與淀粉樣蛋白相關(guān)的疾病。大腸桿菌卷曲菌毛的結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定,一旦卷曲菌毛在體內(nèi)積累形成淀粉樣蛋白,病程將很難逆轉(zhuǎn),目前尚無治療方法。因此,對于卷曲菌毛引發(fā)的炎癥反應的疾病應及早發(fā)現(xiàn)、及早治療,以預防或阻斷疾病的發(fā)生與發(fā)展。在體外,產(chǎn)生卷曲菌毛的大腸桿菌可以形成生物膜。生物膜內(nèi)的大腸桿菌通過降低新陳代謝水平,增強對外界不良環(huán)境因素的適應性,尤其表現(xiàn)在抗生素抗性方面。

5 存在的問題

綜上所述,產(chǎn)生卷曲菌毛的大腸桿菌的致病性比不產(chǎn)生卷曲菌毛的菌株顯著增強。對于卷曲菌毛的研究具有重要的現(xiàn)實意義。大腸桿菌卷曲菌毛的分子生物學特性,大腸桿菌卷曲菌毛在體內(nèi)的致病機制,大腸桿菌卷曲菌毛所致疾病的早期診斷和防控辦法,在體外參與形成生物膜的過程中大腸桿菌卷曲菌毛的具體作用,大腸桿菌是否能通過卷曲菌毛的作用在體內(nèi)形成生物膜,都是值得進一步研究的問題。

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(責任編輯:石瑞珍)