骨質疏松癥大鼠血液中堿性磷酸酶來源方式探討

林社裕，譚湘陵

(南通大學生命科學學院，江蘇南通 226007)

當前國內外的骨質疏松癥的研究主要集中于骨質疏松癥的病因及各種生化檢測指標[1～6]。關于骨質疏松癥患者血清堿性磷酸酶(ALP)水平目前報道不一，其來源方式亦存在爭議。有學者認為系骨質疏松癥發生時靜止的成骨細胞變為活躍的成骨細胞，釋放大量的 ALP入血所致;據此理論治療后ALP應進一步升高，但事實卻與此相反。2009年，我們檢測了骨質疏松癥大鼠血清 ALP水平，現分析結果并探討其來源方式。

1 材料與方法

1.1 材料 40只健康 SD雌性大鼠，4個月齡，體質量 250～280 g，由南通大學實驗動物中心提供。正置金相顯微鏡(Leica DM2500);冰凍切片機(Lei ca CM1900);地高辛隨機引物標記檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);即用型 SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);DIG DNA標記試劑盒(上海美季生物技術有限公司);尼龍膜(羅氏公司);Rabbit Anti-Alkaline Phosphatase(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 模型制備及 ALP檢測 將 40只大鼠隨機分為模型組和假手術組(對照組)各 20只。模型組腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，無菌環境下打開腹腔，摘除卵巢，腹腔分層縫合，肌注青霉素(2萬 U/只)。對照組不卵巢摘除，其他操作與模型組相同。術后 3個月兩組均頸椎脫臼處死，取股骨去盡肌肉與結締組織，截取相應骨組織浸入 4%多聚甲醛中固定 3 d，再浸入 4%EDTA溶液中室溫脫鈣 4周，每周換液1次。脫鈣完成后，取骨組織制作冰凍切片(切片厚度 10μm)，貼片于包被多聚賴氨酸的載玻片上行ALP檢測。①ALP mRNA:采用原位雜交法。冰凍切片首先探針制備(PCR法)，效價驗證;室溫風干，0.1 MPBS浸 10 min，0.1 M甘氨酸/0.1 MPBS浸 5 min，0.3%TritonX-100/0.1 M PBS浸 15 min，0.1 M PBS洗 3次，蛋白酶 K 37℃孵育 30 min，4%多聚甲醛浸 5 min，0.1 M PBS洗 2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1 M三乙醇胺中10 min，預雜交 42℃ 30 min，42℃雜交過夜，洗片，3%BSA/0.05 M PBS包被 30 min，滴加抗地高辛-HRP標記的一抗，4℃孵育過夜，0.05 M PBS洗 4次;TSM1洗 2次，TSM2洗 2次，顯色，乙醇梯度脫水、二甲苯脫脂，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。②ALP蛋白:冰凍切片室溫風干，多聚甲醛固定，H2O2室溫浸泡，蒸餾水洗，5%BSA封閉，加一抗、二抗，DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。原位雜交和免疫組化圖片應用 Scion Image軟件固定，隨機選擇 5個視野行灰度值檢測。

1.3 統計學方法 采用 SPSS15.0統計軟件。多組計量資料均數比較應用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

模型組 ALPmRNA染色強度明顯低于對照組，且其表達主要位于骨組織邊緣，兩組 ALPmRNA表達的灰度值分別為 43.64、62.42(P＜0.01)。兩組ALP蛋白表達特點與 ALP mRNA相同，亦主要位于骨組織邊緣。模型組及對照組 ALP蛋白表達的灰度值分別為 49.8、90.7(P＜0.01)。

3 討論

根據免疫組化結果可以看出，經過去勢后，模型組 ALP含量明顯降低。原因為去勢后，大鼠體內的雌激素的分泌量減少，破壞了體內的激素的平衡，影響了機體的正常代謝，對骨骼而言，出現了破骨細胞骨吸收活性增強，而成骨細胞的骨形成活性有所減弱，打破了骨骼重建的動態平衡[7]。ALP主要由成骨細胞產生，主要作用是產生磷酸基團，促進鈣沉積及骨重建[8]。一旦這種狀態打破，就會導致更多的成骨細胞破壞，成骨細胞中的 ALP便釋放到血液中，引起血液中 ALP活性升高。本研究結果顯示，去勢后大鼠骨組織 ALP mRNA及 ALP蛋白表達均顯著降低，即二者的降低是同時發生的;但尚不能推斷血液中 ALP活性升高是成骨細胞活性增加，進而增加了 ALP合成并分泌到血液中所致。因為如果血液中 ALP活性升高時系成骨細胞分泌增加所致，那么對照組 ALPmRNA表達理論上應低于模型組，而本研究結果正好相反。因此，有理由認為骨質疏松的可能機制為雌激素水平降低，導致破骨細胞的骨吸收增強，成骨細胞的骨形成活性降低，大量的成骨細胞被破壞，導致細胞中的 ALP流失進入組織液或血液，引起血液中 ALP活性升高。

骨質疏松的發生是因為骨骼重建的動態平衡遭到破壞，成骨細胞大量破壞。而藥物治療骨質疏松癥的目的主要是抑制骨吸收，促進骨形成。因此恢復成骨細胞活性，促進成骨細胞增殖，減少成骨細胞破壞是治療關鍵。骨 ALP作為骨形成的重要功能酶之一，并且是骨轉換或骨形成的重要標志分子;有文獻報道，骨髓基質干細胞在向成骨細胞分化時，骨組織 ALP變化比其他指標更敏感[9];此外亦有報道，藥物治療后血液 ALP恢復到正常水平[7，10]。結合本研究結果，成骨細胞的骨 ALP主要是細胞原位表達，而不是以分泌為主。綜合以上結果，骨組織ALP水平可作為其他細胞向成骨細胞分化的一個鑒定指標。本研究的不足之處是未進行體外成骨細胞培養上清及細胞內 ALP活性檢測;檢測指標單一。上述問題將在以后的實驗中加以解決。

[1]Morote J，Trilla E，Esquena S，et al.Analysis of bone alkaline phosphatase asa marker for the diagnosis of osteoporosis in men under androgen ablation[J].Int J Biol Markers，2003，18(4):290-294.

[2]Cantatore FP，Carrozzo M，D'Amore M，et al.Serum osteocalcin in the treatment of senile osteoporosis with anabolic steroids，Further evidences for a new marker of bone formation[J].Clin Rheumatol，1986，5(4):535-536.

[3]Risteli J，Melkko J，Niemi S，et al.Use of amarker of collagen formation in osteoporosis studies[J].Calcif Tissue Int，1991，49(Suppl):S24-S25.

[4]Bonde M，Qvist P，Fledelius C，et al.Applications of an enzyme immunoassay for a new marker of bone resorption(CrossLaps):follow-up on hormone replacement therapy and osteoporosis risk assessment[J].J Clin Endocrinol Metab，1995，80(3):864-868.

[5]Shaarawy M，Hasan M.Serum bone sialoprotein:a marker of bone resorption in postmenopausal osteoporosis[J].Scand JClin Lab Invest，2001，61(7):513-521.

[6]Yu SL，Ho LM，Lim BC，et al.Urinary deoxypyridinoline is a useful biochemical bone marker for the management of postmenopausal osteoporosis[J].Ann Acad Med Singapore，1998，27(4):527-529.

[7]蓋曉丹.卵巢切除后長期補充雌激素女性腰椎骨密度及總堿性磷酸酶觀察[J].中國臨床康復，2003，7(5):810.

[8]魏泉潔，蔣位莊，張曉鈾.骨質疏松癥與退行性骨關節病相關性實驗研究[J].中國骨傷，1999，12(4):14-17.

[9]王嫣，陳小菊，王蘭，等.在海藻酸鈉凝膠上誘導骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞[J].中國生物工程雜志，2006，26(9):38-42.

[10]饒紹琴，鄧君，楊明清.骨堿性磷酸酶同工酶在骨質疏松診斷中的應用[J].四川醫學，1999，20(4):370-371.