外陰鱗狀細胞癌患者癌組織VEGF、Bcl-2基因啟動子的DNA甲基化及其表達

文京華，李伯塤，黃小平，江衛紅，朱彥菲，李武縣

(1深圳市福田區第二人民醫院，廣東深圳518049;2西安交通大學醫學院附屬第二醫院;3深圳市人民醫院)

外陰鱗狀細胞癌(VSCC)是較少見的惡性腫瘤，多見于60歲以上婦女，其病因及發病機制尚未完全明確。近年研究發現，表觀調控機制在腫瘤的發生機制中起重要作用。為探討VSCC的發病機理，我們檢測了VSCC患者癌組織血管內皮細胞生長因子(VEGF)、Bcl-2基因啟動子的甲基化及其表達。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2006年1月～2011年1月在深圳市福田區第二人民醫院和西安交通大學醫學院附屬第二醫院行手術治療的8例VSCC患者，年齡(43.5±9.6)歲;均經病理檢查證實，其中高分化3例，中分化2例，低分化3例;有、無淋巴結轉移各4例;臨床分期Ⅰ～Ⅱ期5例，Ⅲ～Ⅳ期3例。患者均未接受過放、化療。

1.2 檢測方法 取8例患者的癌組織及毗鄰正常皮膚組織(正常組織)手術標本，檢測其VEGF、Bcl-2基因啟動子的DNA甲基化及其表達。

1.2.1 DNA甲基化免疫共沉淀—實時定量聚合酶鏈反應技術檢測DNA甲基化 參考文獻［1］方法，并進行部分改良。即取VSCC及正常組織各25 mg，在液氮中用BioPulverizer粉碎機破碎，抽提DNA;用超聲處理細胞懸液4 min，破碎后，取部分檢測破碎效率，確定基因組DNA片段為200～1 000 bp。向超聲后的各EP管中加入稀釋緩沖液，使其體積均為700 μl，再加入蛋白 G 磁珠懸液 60 μl，4 ℃、垂直混勻器上混勻1 h;將上述EP管置于磁力架中，放置10 min以上，溶液完全澄清后，將上清轉移至新的EP管中;加熱95℃、10 min后，加入5-甲基胞嘧啶抗體8 μg，4℃、垂直混勻器上孵育過夜;加入偶聯二抗兔抗IgG磁珠，4℃、垂直混勻器上孵育2 h;分別用預冷的三種溶液各1 ml，在4℃下依次洗滌Protein G-抗體-DNA復合物，洗完后將EP管放到磁力架上，放置10 min，直至磁珠全部被吸附到管壁上，上清澄清后棄上清;用洗脫液(50 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、1%SDS)400 μl洗滌，向洗脫的MeDIP DNA中加入等體積酚—氯仿溶液抽提DNA。

采用ABI 7700 Realtime PCR儀對免疫沉淀的DNA、未加5-甲基胞嘧啶抗體和偶聯二抗磁珠的DNA、陰性對照進行擴增;測定標準曲線和熔解曲線，用Ct值表示樣品中模板的相對含量，用2－△△CT法進行分析。實時定量PCR反應體系及擴增條件:PCR 反應體積25 μl，含10 × buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2溶液 1.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μl，10 μmol/L特異性上下游引物各1 μl(上海生工公司合成)，10 ×Sybergreen 工作液 0.625 μl，Taq 酶 1 U，DNA模板1 μl。擴增條件為:預變性95℃ 4 min，94 ℃ 10 s，59 ℃ 15 s，81 ℃ 15 s，共40個循環。基因擴增引物序列為:VEGF F:5'AGTAAGAGTTT TAGAGAGAAGTCGA3'，R:5'AACGATATCTATCTATCTATCCGTC3';Bcl-2 F:5'TATTATAAGTTGTCG TAGAGGGGTTAC3'，R:5'CGACTAAATAAAACGTATACCCGAA3'。

1.2.2 實時定量逆轉錄 PCR 采用 Trizol抽提RNA，瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA質量，紫外分光光度計測定A260/A280比值;鑒定RNA純度及定量后，將合格的RNA逆轉錄成cDNA，4℃保存待用。采用Prime5.0統計軟件分析設計引物序列及管家基因GAPDH(略)，熒光定量PCR反應體系及擴增條件與MeDIP-qPCR相同。測定標準曲線和熔解曲線，用Ct值表示樣品中模板的相對含量，用2－△△CT法［2］進行分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，計量數據用±s表示，組間比較用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織的VEGF、Bcl-2甲基化改變 VSCC患者癌組織的VEGF、Bcl-2基因甲基化分別為0.71±0.03、0.76±0.05，正常組織分別為0.98±0.02、1.04±0.03;癌組織的 VEGF、Bcl-2 甲基化程度均低于正常組織(P均＜0.05)。

2.2 不同組織的VEGF、Bcl-2 mRNA表達 VSCC患者癌組織的VEGF、Bcl-2 mRNA表達分別為2.58±0.04、1.01±0.03，正常組織分別為 2.31±0.02、0.96±0.03;癌組織的 VEGF、Bcl-2 mRNA 表達均高于正常組織(P均＜0.05)。

3 討論

DNA甲基化是目前研究的熱點之一，最近大量研究顯示，DNA甲基化異常參與腫瘤的發生、發展［2，3］。腫瘤血管生成受多種血管生成因子和血管生成抑制物調控，VEGF是其中心調控因子。VEGF是一種高度保守的糖蛋白，能直接促進血管生成，增強血管內皮細胞表達黏附分子，通過纖維蛋白溶解酶系統及金屬蛋白酶，降解細胞外基質，促進腫瘤浸潤和轉移［4］。Bcl-2基因是細胞凋亡抑制基因，其編碼產物Bcl-2蛋白可抑制細胞凋亡，參與細胞增殖與凋亡動態平衡的調控。本研究顯示，VSCC患者癌組織的VEGF、Bcl-2基因啟動子呈DNA低甲基化，且低甲基化的 VEGF、Bcl-2 mRNA表達增加。VEGF mRNA高表達可促進VSCC的癌組織血管生成，有利于VSCC生長、轉移;Bcl-2 mRNA高表達可導致細胞凋亡受阻，促進VSCC的癌組織細胞增殖。

綜上所述，本研究認為VEGF、Bcl-2基因啟動子DNA低甲基化可能參與VSCC的發生、發展，其DNA甲基化改變可能可作為VSCC潛在的生物標記物及其表觀治療靶點。

［1］Pulmke N，Santacruz D，Walter J.Comprehensive analysis of DNA-methylation in mammalian tissues using MeDIP-chip［J］.Methods，2011，53(2):175-184.

［2］Watanabe Y，Maekawa M.Methylation of DNA in cancer［J］.Adv Clin Chem，2010，52:145-167.

［3］Huang L，Frampton G，Liang LJ，et al.Aberrant DNA methylation profile in cholangio-carcinoma［J］.World J Gastrointest Pathophysiol，2010，15(2):23-29.

［4］Fondevila C，Metges JP，Foster J，et al.p53 and VEGF express ion are independent predictors of tumour recurrence and survival following curative resection of gastric cancer［J］.Br J Cancer，2004，90(1):206-215.