促紅細胞生成素多克隆抗體及酶標抗體的制備及純化研究

曾昭偉,王學謙

(1.天津醫科大學研究生院,天津 300070;2.天津市天津醫院 檢驗科,天津 300211）

促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO）是一種促進紅系造血前體細胞分化、繁殖的細胞因子,相對分子量為32-39KD,在調節人體循環紅細胞,維持一定濃度中有重要作用。EPO釋放增加導致紅細胞增多,釋放減少則導致紅細胞減少,它和多種疾病相關[1,2]。EPO缺乏最常見的原因是慢性腎衰。而生成過度常見于組織缺氧、血紅蛋白血癥。

EPO含量的高低在某些疾病的診斷中,是重要的檢測項目?，F在,ELISA方法由于簡便快捷、成本低,靈敏度、特異度均較高等優點,成為研究的重要方向。

由于抗EPO抗體可測定有免疫活性的EPO,制備抗體及酶標抗體在ELISA檢測體系中具有重要應用價值。本研究從來源充足、純度較高的rhEPO入手,免疫動物制備多克隆抗體,并標記酶標抗體,為進一步建立EPO相關試劑盒做好準備。

1 材料與方法

1.1 材料(1）主要試劑:rhEPO購自華北金坦生物技術股份有限公司;pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS）;胎牛血清來自天津沃克生物科技公司;BSA購自天津北方天醫化學試劑廠;醋酸鈉、高碘酸鈉、硼氫化鈉均購自天津北方天醫化學試劑廠;弗氏佐劑購自sigma公司。(2）主要儀器:電泳儀購自北京六一儀器廠;PH計、AL104電子天平均購自天津市天馬儀器廠;磁力攪拌器購自天津市華北實驗儀器有限公司;HD-A電腦采集器及HD-3紫外檢測儀均購自上海滬西分析儀器有限公司;微孔濾膜購自Whatman;透析袋購自 specteum;辣根過氧化物酶(HRP）購自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原的純化 純化rhEPO,凝膠在平衡液中充分溶脹處理。把處理好的凝膠預先裝柱,裝好凝膠柱后,用平衡液過洗柱子后上樣,樣品與柱床體積比例為5%,按照體積比是凝膠的5倍,用平衡液0.1M的PBS充分洗滌凝膠,連接收集器和分光光度計,波形會在電腦上反映出來,直到將波形沖至基線,并維持一段時間。換高濃度磷酸鹽充分沖洗直至新的平衡。洗脫液沖洗時體積約為凝膠柱體積的5倍。收集洗脫液洗下的峰,各部分組分應該加入中和液。

1.2.2 兔抗人EPO多克隆抗體的制備及鑒定 用純化的rhEPO抗原純品免疫新西蘭家兔2只,6-8周齡,雄性。(1）每只兔后足腳墊各注射或完全福氏佐劑0.2 ml(相當于卡介苗每兔5 mg）;10-14天后兩側窩淋巴結可腫大,如蠶豆大小,即可作淋巴結注射。(2）第一針于兩側窩淋巴結內注射佐劑抗原乳劑0.5 ml(1 mg/ml）,一側一個淋巴結。每個淋巴結內注射0.25 ml。(3）注射加強針,途徑、劑量同第一針,間隔約2周。(4）試血測效價,合格則放血。從家兔頸動脈處放血,分離血清后,-20℃保存。(5）鑒定:制備瓊脂板,抗原在板的中央,將多克隆抗體倍比稀釋劑3個濃度環形等距分列于外周,37℃保溫24 h。將制備的多克隆抗體,與CEA、PSA抗原采用間接ELISA法進行反應,鑒定特異性。

1.2.3 抗體的親和層析純化 (1）鹽析法粗提純:取2 ml抗體加2 ml生理鹽水,于攪拌下逐滴加入4 ml飽和硫酸銨,硫酸銨的終飽和度為50%,4℃,3 h以上,充分沉淀。離心3 000 rpm,30 min,棄上清,生理鹽水溶解沉淀,逐滴加飽和硫酸銨1 ml,置4℃3 h以上,(NH4）2SO4的飽和度為40%,以0.02M pH 7.4PB溶解至2 ml裝入透析袋。(2）親和層析:用平衡液浸泡SPA-Sepharose 4B凝膠15-30 min,用平衡液充分洗滌直至波形到基線。鹽析過的抗體純化產物加樣,室溫吸附30 min。再用平衡液沖洗至基線,以洗脫雜蛋白。用pH6的洗脫液洗脫,收集峰值出的洗出液。重新洗至平衡后,用pH3的洗脫液洗脫,收集峰值出的洗出液。洗出液各個組分均加入中和液,將含蛋白的洗脫液裝入透析袋,對pH7.4PB(含0.02%疊氮鈉）4℃透析過夜濃縮。洗脫得到的抗體過0.45 μ m 濾膜 。

1.2.4 酶標記EPO抗體 (1）取HRP10 mg,溶入10 mM乙酸鈉溶液中電磁攪拌,直至溶解。加入0.2M的高碘酸鈉,室溫避光攪拌,反應15 min。然后,加入1ml的0.2M乙二醇,室溫下避光輕輕攪拌1 h。用0.2 M的pH9.5碳酸鹽緩沖液G-25凝膠柱洗脫,流速2 ml/min。(2）抗體在透析袋內于0.2 M的pH9.5碳酸鹽緩沖液中4℃電磁攪拌透析過夜。(3）酶與抗體反應:按照酶與抗體體積之比為1∶9的比例混合,避光攪拌反應1 h。加0.1 ml新配的4 mg/ml NaBH4液,混勻,再置4℃1小時終止反應。(4）準備G200層析柱[3]:用平衡液沖至平衡。將所得樣品過柱子,用平衡液沖洗,收集洗脫峰。

2 結果

用SDS-PAGE測定,步驟見文獻[4]。

2.1 EPO抗原純化結果

2.1.1 EPO抗原純化示意圖 見圖1。

圖1 EPO抗原純化

2.1.2 蛋白質含量測定 將待測的純化EPO抗原樣品用PBS做適當 5倍稀釋,分別測定OD280、OD260的值分別為0.87、0.95,設定稀釋液作為陰性對照。按照經驗公式:蛋白質濃度=(1.45 OD280-0.74 OD260）×稀釋倍數,即,濃度=1.45×0.87-0.74×0.95=0.56(mg/ml）。

2.1.3 蛋白質純度測定 SDS-PAGE測定純度。蛋白標準分子量為 14.4 KD、20.0 KD、24.0 KD、35.0 KD、45.0 KD、66.2KD、94.0 KD。在濃縮膠中時,100 V恒壓電泳,待溴酚蘭染料進入分離膠后,調整電壓120V恒壓電泳,直至溴酚蘭遷移至距凝膠下緣1 cm處,停止電泳。用考馬斯亮藍染料R250染色,上樣的EPO抗原蛋白在膠上,相對應地在35 KD附近有明顯的不雜亂的條帶。

2.2 EPO抗體的純化結果

2.2.1 EPO抗體的純化示意圖 見圖2。

圖2 EPO抗體純化示意圖

上圖中,第一個峰為pH=6洗脫出的,第二個則為pH=3洗脫出的。我們對兩者均進行收集。分別加入中和液之后,透析濃縮。

2.2.2 抗體蛋白的含量測定 測定OD280、OD260的值分別為0.97、1.35,根據公式:蛋白質濃度=(1.45 OD280-0.74 OD260）×稀釋倍數,濃度=1.45×0.97-0.74×1.35=0.41(mg/ml）。

2.2.3 抗體效價測定 免疫的兩只家兔血清中EPO抗體效價為 :1∶15 000,1∶20 000。

2.2.4 特異性鑒定 見表1。

表1 EPO多克隆抗體與 rhEPO、PSA、CEA的反應測定

2.3 酶標EPO純化結果

2.3.1 純化結果 見圖3。

圖3 HRP標記抗體洗脫示意圖

本方法為分子篩凝膠過濾,洗脫出的第一個峰是分子量最大的HRP-Ab復合物,后面的兩個峰分別是游離的酶和抗體。

2.3.2 酶標抗體濃度鑒定

酶量(mg/ml）=OD403×0.4=1.04(mg/ml）。IgG量(mg/ml）=(OD280-OD403×0.3）×0.62=2.306(mg/ml）。摩爾比值(E/P）=mg(酶）4/mg(IgG）=1.80。酶結合率=OD403/OD280,值為0.578,一般以標記率0.30-0.60為合格。

一般認為酶量為1 mg/ml摩爾比值在1.5-2.0之間并且酶標記率大于0.3時,ELISA結果最好[5]。

3 討論

現代,基因重組技術的飛速發展,將EPO目的蛋白基因插入表達載體,轉染真核細胞,在誘導劑條件下,可大量地表達rhEPO,成本低,表達量大,已成為制備抗體所用抗原的重要來源[6]。

本研究采用蛋白A凝膠的親和層析法,效果更佳,免疫親和層析可以達到很高的純度[7,8],有時僅一步純化即可達到純化的目的,將抗體結合后洗脫,回收率可達50%以上,和相關報道一致[9],不必三步純化,以免導致回收率下降。本研究結果顯示,蛋白純度較高。

ELISA方法中,檢測待測血清中的抗原量時,需要將酶連接在與抗原結合的二抗上,再通過酶與底物的顯色反應來表示抗原的濃度。HRP與抗體的結合需要交聯劑,常用的交聯方法是改良過碘酸鈉法[10]。HRP分子中與酶活性無關的糖基被過碘酸鈉(NaIO4）氧化為醛基,可以與抗體的氨基反應形成Shiff鍵。獲得的酶標記抗體產率較高,將近70%的HRP與Ig結合,99%的Ig與HRP結合,酶與抗體的活性均無重大損失。

免疫學檢測方法主要有酶聯免疫檢測、放射免疫檢測以及化學發光免疫檢測,但是,放射免疫檢測不可避免的有放射性危害,化學發光法儀器價格昂貴,這些都限制了它們的應用,ELISA方法成為較合適的選擇。本研究從rhEPO的純化入手,免疫動物制得多克隆抗體,抗體特異性強。本研究制備了酶標記抗體,實驗結果證實,在純化過程中,抗原、抗體損失量小,純度較高。完全符合進一步構建ELISA試劑盒的要求。

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