結核分枝桿菌重組Ag85A、Ag85B蛋白免疫原性的研究

尹文東,于 庭,梁 艷,陽幼榮,肖 漓,王 蘭,王 瑩,史迎昌,張俊仙,吳雪瓊*

(1.吉林大學第二醫院,吉林長春 130041;2.中國人民解放軍309醫院全軍結核病研究所北京 100091）

結核病是一種非常古老且迄今為止仍然嚴重影響人類健康的呼吸道傳染病。具有近百年歷史的卡介苗,由于其亞系的變異性和有限的保護作用,在應用中備受爭議[1]。母牛分枝桿菌菌苗(Mycobacterium Vaccae,MV）具有與結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB）相似的抗原[2],富含介導保護性免疫反應的抗原,缺少介導變態反應的抗原,是一種良好的雙向免疫治療制劑[3]。Ag85復合物(主要由Ag85A、Ag85B和Ag85C組成）是MTB分泌的重要蛋白,具有分枝菌酸轉移酶(Mycolyl-transferase）活性,在細胞壁的合成階段發揮重要作用[4]。該復合物可以激發較強的細胞免疫,這對于以細胞免疫為主的機體抗結核反應具有重要意義。本研究將結核分枝桿菌rAg85A和/或rAg85B蛋白與MV聯合免疫小鼠,通過動物實驗觀察兩種蛋白的免疫效果,以期研發現有結核病治療性疫苗的增強劑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物17-20 g、SPF級6-8周齡雌性BALB/c小鼠60只,購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.2 主要試劑及其來源rAg85A、rAg85B蛋白由解放軍309醫院全軍結核病研究所克隆、表達、純化;凍干皮內注射用卡介苗購自成都生物制品研究所;凍干注射用母牛分枝桿菌菌苗(22.5 μ g/支）購自安徽龍科馬生物制藥有限責任公司;辣根過氧化物酶(HRP）標記的山羊抗鼠 IgG、IgG1和 IgG2a購自Southern Biotech;小鼠 ELISPOT試劑盒、Fluorescein Isothiocyanate(FITC）標記的抗鼠 IFN-γ、Phycoerythrin(PE）標記的抗鼠白介素-4(IL-4）、CD3-Percp、CD8-APC、溶血劑、破膜劑和γ 2a/γ同型對照購自美國BD公司。

1.3 動物分組與處理60只小鼠隨機分為下列6組:(1）PBS組:每只小鼠肌肉注射 100 μ l PBS(pH7.4）;(2）BCG組:每只小鼠皮內注射 100 μ l BCG;(3）MV 組:每只小鼠肌肉注射100 μ l MV(22.50 μ g）;(4）rAg85A-MV 組:每只小鼠肌肉注射100 μ l的rAg85A 蛋白(100 μ g）和 MV(22.50 μ g）;(5）rAg85BMV組:每只小鼠肌肉注射 100 μ l的rAg85B蛋白(100 μ g）和 MV(22.50 μ g）;(6）rAg85A-rAg85B-MV組:每只小 鼠肌肉注射 100 μ l的 rAg85A(100 μ g）、rAg85B 蛋白(100 μ g）和 MV(22.50 μ g）;每2 周免疫1次,共免疫3次。末次免疫結束后第14天,摘眼球采血,分離血清用于抗體檢測,抗凝血用于流式細胞術檢測;解剖小鼠取脾臟,分離T淋巴細胞,檢測脾臟分泌IFN-γ的T淋巴細胞斑點數。

1.4 ELISA測定血清抗體以100 μ l rAg85A/rAg85B蛋白(終濃度分別為5 μ g/ml）包被于酶標板中,4℃過夜;用PBST(含0.05%吐溫20的PBS）洗板3次 ;每孔加入 200 μ l含 10%胎牛血清(FBS）的PBS,37℃封閉1小時,PBST洗板3次;加入1∶100倍稀釋的待測血清,37℃溫育2小時,PBST洗板5次;加入1:6000倍稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a抗體,37℃溫育1小時,PBST洗板7次;加入TMB底物顯色15分鐘,2 mol/L硫酸終止反應。以空白對照調校零點,酶聯免疫檢測儀測定450 nm的OD值,以兩孔平均值作為終結果。

1.5 ELISPOT檢測脾臟分泌IFN-γ的T淋巴細胞斑點數小鼠脾臟在200目細胞篩上研磨,將懸液離心,用淋巴細胞分離液和細胞培養液RPMI-1640離心、洗滌、制備淋巴細胞懸液,調節脾淋巴細胞濃度為4×106/ml。每份標本需微孔板3孔,先向每孔加入100 μ l淋巴細胞懸液,再向陰性孔、陽性孔和檢測孔中分別加入細胞培養液、植物血凝素(終濃度為20 μ g/ml）、rAg85A/rAg85B 蛋白(終濃度分別為 20 μ g/ml）,置 37℃CO2溫箱中溫育 48小時,按照ELISPOT試劑盒說明操作。以各組小鼠空白對照孔為對照,計算各組小鼠檢測孔的細胞斑點數。

1.6 流式細胞術檢測全血單個核細胞內Th1、Th2百分比每個標本取一支有蓋的Faclon管,各加入500 μ l抗凝血 、500 μ l細胞培養液 RPMI-1640 和22 μ l rAg85A/rAg85B蛋白(終濃度分別為20 μ g/ml）,混勻后置于37℃避光孵育4-6小時;每份標本取兩支試管 ,標記1-對照 ,2-樣本,每管各加入 200 μ l刺激好的血,再分別加入CD3-Percp和CD8-APC,混勻后置室溫避光孵育10分鐘;加入破膜的A液,混勻后避光孵育5分鐘;用蒸餾水按1∶10稀釋溶血素,每管各加入2 ml,混勻后避光孵育10分鐘;取出后1 200 rpm離心5分鐘,棄去上清,加入破膜的B液,同時加入胞內熒光抗體,1管加入同型對照γ 2a/γ,2管加入IFN-γ-FITC/IL-4-PE,振蕩混勻,室溫避光孵育15分鐘;每管各加入含2%FBS的PBS,1 200 rpm離心5分鐘,棄上清;各加入500 μ l PBS,應用BD 公司FACSCalibur流式細胞儀進行分析。

1.7 統計學分析所有計量數據均用ˉx±s表示。使用SPSS11.5統計軟件進行單因素方差分析。假設檢驗的顯著性水準取 α=0.05。

2 結果

2.1 小鼠血清抗體水平通過ELISA方法檢測各組小鼠血清中抗rAg85A/rAg85B蛋白抗體IgG、IgG1和IgG2a的結果見表1。三個實驗組小鼠血清抗體水平均顯著高于三個對照組(P＜0.001）,三個實驗組間無顯著差異(P＞0.05）;BCG組和MV組小鼠抗體水平也顯著高于PBS組(P＜0.05）;各組小鼠IgG2a水平均略高于IgG1。

2.2 小鼠脾臟分泌IFN-γ的T淋巴細胞斑點數用ELISPOT方法檢測各組小鼠脾臟分泌IFN-γ的T淋巴細胞斑點數的結果見表2。三個實驗組和兩個陽性對照組分泌IFN-γ的T淋巴細胞斑點數均顯著高于PBS組(P＜0.05）,升高最多的是BCG組,其次是rAg85A-rAg85B-MV組和MV組,這三組間無顯著差別(P＞0.05）。

表1 各組小鼠血清中抗rAg85A/rAg85B蛋白抗體水平

表2 小鼠脾臟分泌IFN-γ的 T淋巴細胞斑點數

2.3 全血單個核細胞內Th1、Th2百分比及 Th1/Th2比值流式細胞術檢測小鼠全血單個核細胞內Th1、Th2百分比及Th1/Th2比值的結果見表3。Th1百分比結果顯示:rAg85A-rAg85B-MV組小鼠較其它5組升高最顯著(P＜0.001）;MV組較陰性對照組升高較多(P＜0.05）,低于三個實驗組分泌水平(P＜0.05）,與BCG組無顯著性差異(P＞0.05）;rAg85AMV組與rAg85B-MV組無顯著差別(P＞0.05）。Th2百分比結果顯示:MV組較陰性對照組和三個實驗組升高顯著(P＜0.05）,與 BCG組差別不大(P＞0.05）;三個實驗組與PBS組間也無顯著差別(P＞0.05）。三個實驗組Th1/Th2比值均明顯高于三個對照組(P＜0.05）,rAg85A-rAg85B-MV組較其它5組升高最顯著(P＜0.001）。

表3 全血單個核細胞內 Th1、Th2的百分比及Th1/Th2 比值 (±s）

表3 全血單個核細胞內 Th1、Th2的百分比及Th1/Th2 比值 (±s）

組別 小鼠數量(只）Th1(%） Th2(%） Th1/Th2 PBS 10 0.89±0.48 4.23±2.36 0.21±0.01 BCG 10 1.58±0.34 5.96±0.38 0.26±0.04 MV 10 2.29±0.61 8.10±1.37 0.28±0.05 rAg85A-MV 10 2.84±0.28 5.03±1.52 0.59±0.14 rAg85B-MV 10 3.70±0.25 4.61±0.53 0.81±0.13 rAg85A-rAg85B-MV 10 6.17±1.21 4.23±1.5 71.56±0.40

3 討論

世界衛生組織20世紀90年代關于結核病研究與發展規劃中指出:MV是唯一被推薦的免疫治療制劑。其藥效學和免疫學研究顯示:MV能促進T淋巴細胞的增殖反應;啟動Th1型細胞免疫,刺激機體產生IFN-γ和IL-2。動物實驗證明:用MV免疫小鼠,再感染MTB后,小鼠脾臟分泌多量IFN-γ和IL-2[5],可有效的抵御MTB的感染。MV用于人類結核病治療具有一定的促進菌陽肺結核陰轉、空洞閉合、縮短療程的作用。Johnson[6]等報道:選擇新近診斷的肺結核病人,化療7天后,實驗組加用MV,對照組加用安慰藥,實驗組1個月后痰菌陰轉率及6個月后胸片改善情況均好于對照組(P＜0.05）。曹賦[7]等收治了328例復治肺結核患者,隨機分為MV+化療組和單純化療組,經過半年治療后,發現MV聯合化療組的空洞閉合率較單純化療組明顯升高(P＜0.001）。因MV應用方法簡便,無毒性反應,不良反應輕微,目前在臨床上已廣泛用于結核病的輔助治療。

Ag85復合物是目前在結核病疫苗研制方面最受關注的抗原。周曄[8]通過實驗證明:重組Ag85A蛋白具有較好的免疫原性,能有效刺激外周血單個核細胞產生細胞增殖反應和細胞毒活性。Giri[9]應用Ag85AB融合蛋白疫苗治療小鼠結核病模型,實驗組小鼠脾臟和肺臟細菌數較對照組顯著減少(P＜0.05）,治療后的小鼠不但增強了Th1型免疫反應,而且抑制了IL-4的分泌。綜合以上研究報道,本實驗將rAg85A、rAg85B蛋白與MV聯合應用,研究其免疫效果,以尋求提高MV治療效果的增強劑。目前國內外尚未見報道。

本文研究結果顯示,rAg85A和/或 rAg85B蛋白與MV聯合免疫后,小鼠血清中抗 rAg85A和/或rAg85B蛋白抗體水平均顯著高于三個對照組,說明rAg85A和rAg85B蛋白具有較好的免疫原性,與MV聯合免疫成功。姜德華[10]等用Ag85B/ESAT6融合蛋白,聯合DDA/MPL為佐劑免疫BALB/c小鼠,其產生的特異性IgG抗體效價較對照組明顯升高,本實驗中MV本身具有免疫佐劑作用,與Ag85聯合應用,無需另外加佐劑便可獲得較好的免疫效果。目前研究表明BALB/c小鼠IgG2a升高代表機體主要是以Th1型反應為主,IgG1升高代表機體主要是以Th2型反應為主。本研究各組小鼠血清IgG2a水平均略高于IgG1,說明各組小鼠的免疫狀況以Th1型反應為主。Giri[11]等用Ag85AB復合蛋白免疫小鼠后,產生了抗Ag85AB蛋白的特異性IgG抗體,且IgG2a水平較高。本實驗結果與報道符合。

IFN-γ是Th1類細胞分泌的最重要的免疫分子,貫穿于抗結核的整個過程,它不僅可以激活巨噬細胞,酸化吞噬體,還可增強自然殺傷細胞的能力,刺激細胞毒T淋巴細胞的增殖分化。Young[12]以一種高度減毒的牛痘病毒(modified vaccinia ankara virus,MVA）為載體,將編碼Ag85A的基因導入其中,組成重組疫苗免疫小鼠,激發了強烈的Th1型反應。本文通過ELISPOT方法檢測各組小鼠脾臟分泌IFN-γ的T淋巴細胞斑點數,結果顯示三個實驗組和兩個陽性對照組小鼠的T淋巴細胞斑點數均高于陰性對照組,證明 BCG、MV、rAg85A 和/或 rAg85B蛋白與MV聯合免疫均具有較強的刺激T淋巴細胞分泌IFN-γ的能力。

全血單個核細胞內Th1、Th2百分比及Th1/Th2比值可以反應機體的免疫應答類型,Th1百分比升高代表機體以細胞免疫為主,Th2百分比升高代表機體以體液免疫為主。本研究通過流式細胞術檢測發現,三個實驗組Th1型細胞百分比及Th1/Th2比值較三個對照組均有升高,進一步證明rAg85A和rAg85B蛋白聯合MV可以明顯增強小鼠的Th1型細胞免疫反應;BCG組和MV組小鼠Th2百分比升高較高,說明二者不僅可以產生細胞免疫,也可刺激機體產生較強的體液免疫。Malowany[13]等也獲得類似的結果,他們將表達Ag85A的樹突狀細胞制成疫苗,發現其在提高CD4+T細胞、CD8+T細胞百分比及CD4+/CD8+比值方面均較單獨Ag85A蛋白疫苗升高顯著。Lozes[14]等用Ag85A、Ag85B和Ag85C疫苗免疫小鼠,結果顯示:前兩種DNA疫苗的免疫效果較好,可刺激小鼠產生較高的IFN-γ,IL-12和腫瘤壞死因子,而IL-4、IL-6和IL-10水平較低或檢測不出,間接反映出Ag85A和Ag85B能夠升高Th1型細胞比例,抑制Th2型細胞分泌。

總之,結核分枝桿菌rAg85A和rAg85B蛋白具有很強的免疫原性,與MV聯合免疫可增強其Th1型細胞免疫應答。我們將在結核病動物模型上進一步研究它們聯合免疫的治療效果。

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