體外誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞

劉紅敏,陳旭東,華新宇

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校組織胚胎學(xué)教研室,河南漯河 462002）

近年來雖然胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)病變已取了成績(jī),但胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞取材難,且有倫理方面和移植后易形成瘤的困擾,而骨髓基質(zhì)細(xì)胞要跨胚層分化且取材時(shí)對(duì)機(jī)體損傷大,對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療也不盡人意。近年來研究證明人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cells,hAECs）具有部分胚胎干細(xì)胞特性[1-2],可分化為3個(gè)胚層不同類型的細(xì)胞[3-6],誘導(dǎo)劑和方法被認(rèn)為是關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)比較了兩種化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)人羊膜細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化的情況,以尋求一種較為理想的誘導(dǎo)劑及方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MEM培養(yǎng)基購自(美國(guó)Gibico公司）;人羊膜上皮細(xì)胞WISH細(xì)胞株購于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所;小鼠抗人NSE、GFAP單克隆抗體、兔抗鼠SP-Kit檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒(棕黃色）均購于北京中杉金橋生物工程公司;胎牛血清(購自杭州四季青生物工程材料有限公司）;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF）、全反式維甲酸(alltransretinoic acid,ATRA）、丁酸羥基茴香醚(butyl hydroxy anisd,BHA）、胰酶購于sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)誘導(dǎo)液和誘導(dǎo)液的配制 以含10%胎牛血清和10 μ g/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的MEM培養(yǎng)基作為預(yù)誘導(dǎo)液;以含1 μ mol/L全反式維甲酸和無血清的的MEM培養(yǎng)基作為一種誘導(dǎo)液;以200 μ mol/L丁酸羥基茴香醚和無血清的MEM培養(yǎng)基作為另一種誘導(dǎo)液。

1.2.2 細(xì)胞的準(zhǔn)備 人羊膜WISH細(xì)胞懸于10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基,按2×104個(gè)/ml接種于25 ml培養(yǎng)瓶中,置37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h換液后,除去未貼壁的細(xì)胞和殘?jiān)５怪蔑@微鏡下觀察,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)用0.25%胰酶消化傳代準(zhǔn)備誘導(dǎo)。

1.2.3 人羊膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化 預(yù)誘導(dǎo)hAECs按2×105個(gè)/ml密度接種于預(yù)先置6孔板中制備細(xì)胞爬片,每孔加含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),待細(xì)胞80%融合時(shí),吸去孔中的培養(yǎng)液。將細(xì)胞分為3組,第一組為對(duì)照組,加入等量的含血清MEM培養(yǎng)基,第二組為全反式維甲酸誘導(dǎo)組加入預(yù)誘導(dǎo)液(10%胎牛血清+10 μ g/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子+MEM培養(yǎng)基）,第三組為丁酸羥基茴香醚誘導(dǎo)組加入預(yù)誘導(dǎo)液(10%胎牛血清+10 μ g/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子+1 mmol/L巰基乙醇+MEM培養(yǎng)基）,三組培養(yǎng)24 h。吸棄孔中液體后用D-Hank,s液洗兩次,ATRA誘導(dǎo)組加入含1 μ mol/L全反式維甲酸和無血清的的MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),BHA誘導(dǎo)組加入含200 μ mol/L丁酸羥基茴香醚和無血清的MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),對(duì)照組為等量的無血清MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) 誘導(dǎo)12 h后的細(xì)胞用0.1 MPBS洗滌2次后,用4%多聚甲醛固定30 min,用0.1%TritonX-100作用10 min,0.1M PBS洗3次,余下步驟按免疫組織化學(xué)染色試劑盒說明操作(SP法）。一抗為1∶100小鼠抗人神經(jīng)元烯醇化酶(NSE）單克隆抗體和1∶100小鼠抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP）單克隆抗體。DAB顯色,光鏡觀察,隨機(jī)取10個(gè)不同視野(×100）,計(jì)算神經(jīng)元樣細(xì)胞占總細(xì)胞的比例,結(jié)果用(ˉx±s）表示。以PBS為一抗作陰性對(duì)照。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組間比較用方差分析,兩兩比較用LSD法檢驗(yàn)。采用SPSS15.0軟件包完成數(shù)據(jù)分析(P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

hAECs經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)液作用24 h后,無明顯形態(tài)變化。ATRA組加入誘導(dǎo)液ATRA后,2 h后開始發(fā)生形態(tài)變化,hAECs的胞體向內(nèi)收縮,呈球形或錐形,并向周圍長(zhǎng)出較長(zhǎng)的突起,12 h后部分細(xì)胞出現(xiàn)雙極或多極的細(xì)胞突起,少數(shù)細(xì)胞突起末端還出現(xiàn)分支,轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃粕窠?jīng)元的形態(tài),24 h后神經(jīng)元樣細(xì)胞未見明顯增多,但少量細(xì)胞突起連接成網(wǎng)狀,誘導(dǎo)48 h后,神經(jīng)元樣細(xì)胞逐漸萎縮;而BHA組加入誘導(dǎo)液后,細(xì)胞生長(zhǎng)速度較ATRA組慢,細(xì)胞形態(tài)幾乎無發(fā)生改變,對(duì)照組細(xì)胞一直保持寬大的多邊形狀態(tài),細(xì)胞無明顯增殖。3 d后見到不少漂浮的細(xì)胞。

2.2 誘導(dǎo)分化細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)顯色鑒定(圖1）

對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)仍然呈寬大多邊形NSE陽性細(xì)胞,誘導(dǎo)12 h后,ATRA組NSE免疫組化顯示陽性細(xì)胞胞質(zhì)著色染為棕黃色,胞核不著色,BHA組細(xì)胞NSE陽性細(xì)胞胞質(zhì)著色染為棕黃色。誘導(dǎo)組和對(duì)照組GFAP染色基本無陽性細(xì)胞顯示。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

每組隨機(jī)選取10個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)分析陽性細(xì)胞率差異具有顯著性(表1）,其中以ATRA組陽性率最高,對(duì)照組陽性率最低。

3 討論

目前人羊膜上皮細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化誘導(dǎo)、調(diào)控方面的研究很少,人羊膜WISH細(xì)胞來源于正常足月妊娠的人羊膜上皮細(xì)胞,對(duì)研究人羊膜上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性有重要作用[7]。也是體外研究羊膜上皮細(xì)胞的生物特性及其功能調(diào)節(jié)的有效實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

表1 三組NSE、GFAP陽性細(xì)胞百分比例值(±s）%

表1 三組NSE、GFAP陽性細(xì)胞百分比例值(±s）%

P＜0.05

組別 NSE GFAP對(duì)照組 (38.43±1.61） 0 ATRA組 (91.86±2.62） 0 BHA 組 (63.12±1.25） 0

蔡哲[8]等研究表明羊膜組織中存在神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白Nestin表達(dá)陽性細(xì)胞,而且其中存在已分化的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。ATRA是一種強(qiáng)烈的神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑,目前應(yīng)用全反式維甲酸誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞或骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化研究較多,在本研究當(dāng)中,ATRA誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞12小時(shí)后大部分hAECs可轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細(xì)胞,并有雙極和多極突起的出現(xiàn),誘導(dǎo)24 h后一些神經(jīng)元之間可形成網(wǎng)狀,結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果,誘導(dǎo)12 h時(shí),ATRA誘導(dǎo)組大部分細(xì)胞呈NSE陽性,NSE是神經(jīng)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物,與Strbing等用ATRA處理胚胎干細(xì)胞后幾乎全部細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)果一致,同一時(shí)段,出現(xiàn)形態(tài)變化的hAECs數(shù)量與NSE陽性細(xì)胞數(shù)量基本一樣,提示形態(tài)和表型在誘導(dǎo)過程中都發(fā)生了明顯的變化,提示hAECs在ATRA誘導(dǎo)下,不僅從形態(tài)上,而且在分子水平上皆有向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的改變。BHA和巰基乙醇均為強(qiáng)的抗氧化劑,BHA的抗氧化作用更強(qiáng),常用作神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)劑[9],本研究中BHA組陽性率低于ATRA誘導(dǎo)組但高于對(duì)照組,且BHA組NSE陽性細(xì)胞形態(tài)并未發(fā)生明顯變化。三組中GFAP標(biāo)志物均呈陰性,說明誘導(dǎo)分化出的細(xì)胞不是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。但誘導(dǎo)后的細(xì)胞是否具有神經(jīng)細(xì)胞的生理功能,成為真正意義上的神經(jīng)細(xì)胞,能否合成分泌神經(jīng)遞質(zhì),與其他細(xì)胞和組織建立突觸聯(lián)系,傳遞和接受神經(jīng)沖動(dòng)從而具有神經(jīng)細(xì)胞的生理功能,還有待進(jìn)一步深入研究。

血清會(huì)增加培養(yǎng)基的復(fù)雜性,抑制細(xì)胞分化[10],因此本實(shí)驗(yàn)采用無血清的MEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo),以更有效促進(jìn)hAECs分化;3 d后倒置顯微鏡下見到部分細(xì)胞漂浮,可能與誘導(dǎo)液中缺乏血清營(yíng)養(yǎng)有關(guān)。

從發(fā)育生物學(xué)角度來講,人羊膜上皮細(xì)胞源于外胚層成羊膜細(xì)胞,保持著早期外胚層細(xì)胞的多潛能特性,而神經(jīng)元也來源于外胚層,分化無需跨胚層,此外,人羊膜上皮細(xì)胞源于大量被遺棄的胎盤,是再生醫(yī)學(xué)中沒有爭(zhēng)議的細(xì)胞來源,因此人羊膜上皮細(xì)胞可作為移植的前體細(xì)胞來源。hAECs向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化將有望在神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性病變疾病的治療方面打開更廣闊的應(yīng)用前景。

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