丹參多酚酸鹽對匹魯卡品致癇大鼠BDNF表達的影響

陳麗麗,黃靚妹,詹紅艷,曹亦賓,史 楠,黎 潔,王丹丹

(唐山工人醫院 1.神經內科;2.急診內科,河北 唐山 063000）

腦源性生長因子(BDNF）是神經生長因子家族的一員,研究發現BDNF與癲癇密切相關,組織缺血缺氧后腦內BDNF釋放量明顯增多,且對癲癇有保護作用。丹參多酚酸鹽注射液是國家二類中藥新藥。自2005年5月獲批應用以來,證實它具有抗血小板聚集、抗血栓形成、改善微循環、抗氧化損傷的作用。本課題擬采用免疫組織化學方法觀察匹魯卡品(PILO）所致大鼠腦內BDNF的表達,探討丹參多酚酸鹽干預注射后對大鼠腦內BDNF的表達影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性成年Wistra大鼠15只,體重200-250 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。將動物置于20℃、安靜的環境中飼養。匹魯卡品(PILO）,美國SIGMA公司;,兔抗大鼠BDNF多克隆抗體與SABC免疫組化試劑盒,均由武漢博士德公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 將大鼠隨機分為(1）丹參多酚酸鹽干預組5只,用2%戊巴比妥鈉0.1 ml/50 g將大鼠麻醉,固定于立體定位儀上,按大鼠解剖圖譜取前囟后2.0 mm、左旁開1.0mm,鉆開顱骨,校準微量進樣器,抽取10 mg/kg,垂直進針至硬腦膜下3.5 mm(左側腦室）,注射完畢后拔出進樣器,撒上青霉素粉預防感染,縫合皮膚后放回飼養籠內;第二天先腹腔注入東莨宕堿1 mg/kg,以拮抗其外周膽堿能反應,半小時后腹腔注射匹魯卡品(PILO）350 mg/kg。(2）生理鹽水干預組5只,用相同的方法側腦室注入等量生理鹽水,第二天腹腔注射PILO350 mg/kg。(3）對照組5只,給大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。觀察上述各組大鼠有無癲癇發作。

1.2.2 標本處理 將實驗動物在腹腔給藥后12小時麻醉,固定在立體定位儀上,剪開胸腹腔,暴露心臟、肝臟,自心尖向右上45°進針至主動脈起始端。快速灌注生理鹽水100 ml后接4%多聚甲醛(PF）200ml灌注。若大鼠出現四肢僵直、肝臟變白立即停止灌注。剪開顱骨,取中腦至小腦之間的腦組織,放入4%PF后固定2小時,最后移入30%蔗糖溶液4℃過夜。

1.2.3 冰凍切片 將腦組織修材并固定于基座上,自中腦向后行20 μ m冠狀連續切片,并放入磷酸鹽緩沖液中用于BDNF免疫組化。

1.2.4 BDNF的SABC免疫組織化學染色 組織片飄浮于PBS配制的1%H2O2中,室溫下10 min消化內生過氧化物酶,PBS 5 min/次洗 2次;然后按SABC免疫組織試劑盒說明進行染色。用PBS取代一抗作陰性對照。置換試驗用正常兔血清代替兔抗大鼠BDNF多克隆抗體。BDNF陽性細胞計數:在光學顯微鏡下,每組隨機抽取5張切片6個高倍視野。計算海馬CA1區高倍視野下的BDNF陽性細胞數。

1.3 數據分析

所有數據采用SPSS 13.0進行統計分析。數據表示為ˉx±s。BDNF陽性細胞均數各組間比較行t檢驗,統計顯著性為P＜0.05。

2 結果

2.1 行為學觀察

根據Racine[1]制定的標準判定癲癇發作:Ⅰ級:面部陣攣;Ⅱ級:面部陣攣+節律點頭;Ⅲ級:面部陣攣+節律點頭+前肢陣攣;Ⅳ級:面部陣攣+節律點頭+前肢陣攣+后肢站立;Ⅴ級:面部陣攣+節律點頭+前肢陣攣+后肢站立+跌倒。5只鹽水干預組大鼠在注射PILO后10-20分鐘均可見癲癇發作。但丹參多酚酸鹽組有4只大鼠在注射PILO后30-40分鐘見癲癇發作,但程度較弱。對照組無癲癇發作。

2.2 BDNF免疫組化結果

各組海馬CA1區BDNF陽性細胞數(見表1）,生理鹽水及丹參多酚酸鹽干預組均可見到顆粒細胞及椎體細胞中的BDNF的表達。NS、丹參多酚酸鹽干預組BDNF陽性細胞數高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05）;而且丹參多酚酸鹽組高于生理鹽水組,差異有統計學意義(P＜0.05）。BDNF陽性細胞數形態見圖1。

表1 各組海馬 CA1區BDNF陽性細胞數(±s）

表1 各組海馬 CA1區BDNF陽性細胞數(±s）

注:*與對照組比較(P＜0.05）,差異有統計學意義;#與NS組比較(P＜0.05）,差異有統計學意義。

組別 n BDNF陽性細胞數NS干預組 5 14.520±2.836*丹參多酚酸鹽干預組 5 25.631±3.154*#對照組 5 8.625±1.175

圖1 BDNF陽性細胞數形態(BDNF免疫組化染色,×400）

3 討論

腦源性生長因子是神經生長因子家族中的一員,它是1982年從豬腦中分離到的,由120各氨基酸殘基組成的細胞外因子。BDNF除了對特異性神經元的存活、鑒別和維持其功能方面起作用外,也對突觸遞質有急性的敏銳的興奮作用,能調節神經遞質的釋放、誘發谷氨酸受體翻譯后調節。神經元內BDNF主要定位于細胞體和軸突,海馬顆粒細胞軸突苔狀纖維有明顯的BDNF免疫活性。在中樞神經系統中,軸突是 BDNF發揮作用的主要部位。Tsankora[2]等研究發現,癲癇持續發作后海馬、內嗅皮層、杏仁核、外周皮層中BDNF的表達明顯增高。本研究中,生理鹽水及丹參多酚酸鹽干預組均可見到顆粒細胞及椎體細胞中的BDNF的高表達,這與文獻報道一致。Vezzami[3]等研究發現:在癲癇發作后100分鐘時,BDNF的免疫反應性在海馬CA1區、齒狀回和內嗅皮層內顯著升高。林衛紅[4]等在大鼠杏仁核點燃癲癇模型中,發現大鼠顳葉和海馬BDNF的表達隨著癲癇發作次數的增加而增高。有人對癲癇發生過程中BDNF增高的機制進行了研究,在海人藻酸(Kainic acid KA）誘導的癲癇模型中發現依賴Ca2+/鈣調蛋白的蛋白激酶Ⅱ、Ⅳ的抑制劑KN-62能阻斷癇后BDNF mRNA水平的升高,這說明依賴Ca2+/鈣調蛋白的蛋白激酶Ⅱ、Ⅳ是引起癲癇發作后BDNF mRNA水平升高的一個必要環節。Hagihara等[5]研究發現匹魯卡品誘發的癲癇模型中BDNF的高表達具有促進新生神經細胞增殖的作用。

丹參能緩解缺血腦組織單胺類神經遞質和神經肽的紊亂,減少癇樣放電,抑制腦缺血所致的β-腦啡肽異常升高,減輕腦損傷和腦水腫[6]。丹參多酚酸鹽注射液主要是丹參的水溶性活性成分,具有改善微循環、抗氧化損傷、提高驚厥閾的作用,可通過多途徑發揮細胞保護作用,促進內皮細胞遷移,促進血管生成[7]。癲癇發作引起內源性BDNF蛋白的表達增強,與興奮-抑制性神經遞質GABA-Glu平衡失調而致的興奮性增高密切相關,這些變化可能是導致神經損傷的重要因素。本研究中,側腦室注入丹參多酚酸鹽后腹腔注射PILO,丹參多酚酸鹽干預組BDNF的表達更多,細胞著色更深。丹參多酚酸鹽能明顯降低急性癲癇痙攣性大鼠的發作等級和發作時間,可能與調節神經GABA-Glu的失衡,促進神經元修復有關,使癲癇發作后海馬區BDNF的表達增高,產生特異性抑制神經元損傷的作用。其具體作用機制和作用途徑有待進一步研究。

[1]Racine RJ,Gartner JG,Burnham WM.Epileptifor m activity and neural plasticity in limbic structures[J].Brain Res,1972,47:262.

[2]Tsankora NM,KumarA,Nestler EJ.Histone modifications at gene promoter regions in rat hippocampus after acute and chronic electroconvulsive seizures[J].J Neurosci,2004,24(24）:5603.

[3]Vezzami A,Ravizza T,Moneta D,et al.Brain-derived neurotrophic factor immunor eactivity in the limbic system of rats afteracute seizures and during spontaneous conrulsions:temporal evolution of changes as compared to neuropeptide Y[J].Neuroscience,1999,90(4）:1445.

[4]林衛紅,孟紅梅,呂玉丹,等.BDNF及其受體TrkB在實驗性癲癇中的作用及意義探討[J].中國神經免疫學和神經病學雜志,2007,14(1）:11.

[5]Hagihara H,Hara M,Tsumekawa K,et al.Tonx-clonic seizures induce division of neuronal progenitor cells with concomitant changes in expression of neurotrophic factors in the brain of pilocarpine treated mice[J].Brain Res Mol Brain Res,2005,139(2）:258.

[6]劉寶軍,劉 峰,高 云,等.慢性癲癇大鼠海馬谷氨酰胺合成酶的改變及丹參對其的影響[J].河北醫科大學學報,2005,26(2）:131.

[7]黃秋玲,唐洪麗.丹參注射液對發育期癲癇大鼠腦源性神經生長因子影響[J].江西中醫藥,2010,41(5）:72.