CpG ODN聯合凋亡腫瘤細胞相關抗原致敏樹突狀細胞殺傷SKOV3卵巢癌細胞的實驗研究

葉明珠,李 娜,黃秀敏

(廈門大學附屬中山醫院婦產科,福建廈門 361004）

腫瘤免疫的最終目的即達到殺傷腫瘤細胞、阻止腫瘤的復發和轉移。以往單純利用凋亡腫瘤細胞作為腫瘤免疫的初始抗原,其因抗原性弱,難以達到理想的抗腫瘤免疫效果。近年來的動物實驗研究表明,人工模擬細菌基因組DNA合成的含有至少一個未甲基化“CpG基序”的單鏈寡脫氧核苷酸是一類新型的免疫制劑,具有強效的免疫刺激功能。它能夠以病原相關的分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP）,促進多種免疫細胞的活化,進而誘導機體產生特異性抗腫瘤免疫反應及持久的保護性免疫反應[1]。本研究采用人工合成的CpG ODN2006聯合凋亡的SKOV3卵巢癌細胞相關抗原(tumor associated antigens,TAAs）體外沖擊致敏DCs,探討CpG ODN對DCs促分化成熟的作用;同時體外觀察致敏DCs對細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs）殺傷SKOV3卵巢癌細胞活性的影響,以期為CpG ODN聯合TAAs在抗卵巢癌免疫中的應用提供一些重要的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人外周血每份20 ml,肝素抗凝;人卵巢癌細胞株SKOV3、人宮頸癌細胞株Hela、人肺癌細胞株Lewis由吉林大學病理教研室提供。

1.2 主要試劑CpG-ODN2006(5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'）,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,全硫代磷酸化修飾,PAGE純化。MTT(華美生物工程公司）;絲裂霉素C(Sigma公司）;異硫氰酸熒光素(FITC）標記的CD1α、CD83、CD86和HLA-DR 單克隆抗體(BD Pharmingen公司）;GM-CSF/IL-4(Sigma Aderch公司）;IL-12 ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司）;RPMI1640培養基(Gibco公司）;淋巴細胞分離液(鼎國試劑公司）。

1.3 方法

1.3.1 人外周血單核細胞的分離和培養 取人外周血20 ml,肝素抗凝,用等體積Hanks液稀釋后加入淋巴細胞分離液,1 500 r/min離心15 min,吸取界面細胞即獲得外周血單核細胞,PBS洗滌2次。將獲得的外周血單核細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養基調細胞濃度為2.0×106/mL,置37℃,5%CO2孵箱培養2 h,洗去未貼壁細胞,獲得貼壁的單核細胞,每孔加入含GM-CSF1000 KU/L、IL-41000 KU/L的完全培養基,隔天半量換液。第7天收集疏松粘附細胞,即為DC。倒置顯微鏡下觀察DC的形態及生長情況。

1.3.2 TAAs的制備 將貼壁對數生長的SKOV3卵巢癌細胞經0.25%胰蛋白酶消化后,加入RPMI1640完全培養基,調細胞濃度為1.0×108/L,接種于96孔板,每孔100 μ L,置37℃,5%CO2孵箱培養。收集處于對數生長期的SKOV3細胞,調細胞濃度為1.0×1010/L,1 000 r/min離心5 min,沉淀用含10%胎牛血清的 RPMI1640懸浮,反復凍融(-80℃/37℃）3次,15 000 r/min離心30 min,收集上清液微孔濾膜過濾作為TAAs。

1.3.3 流式細胞儀檢測CpG ODN致敏DCs表面分子的表達以完全培養基調DCs濃度至1×109/L,于24孔細胞培養板中每孔加入1 ml。分別加入10 mg/LCpG ODN 、10 mg/L TAA 、10 mg/LCpG ODN+10 mg/L TAA,設LPS陽性對照及陰性對照。培養72h后收集細胞,FACS檢測細胞表面CD1α、CD83、CD86和HLA-DR表達水平,計算熒光染色陽性細胞的百分率。

1.3.4 ELISA法檢測IL-12分泌水平 收集上述各組DCs的培養上清液,按ELISA試劑盒說明檢測各組DC培養上清液中IL-12的分泌水平,酶標儀測定490nm波長下的吸光度值,計算IL-12的濃度。

1.3.5 T淋巴細胞的制備 將貼壁培養DCs后獲得的非貼壁細胞經尼龍毛柱過濾后粘附去除B淋巴細胞,洗脫后所得細胞主要為T淋巴細胞。

1.3.6 測定致敏DCs對T淋巴細胞的增殖活性 將培養的各組DCs經絲裂霉素C處理30 min后,重懸于完全培養基中,分別以每孔2×105、1×105、5×104加入96孔板;另將獲得的T淋巴細胞用完全培養基調細胞濃度 1×109/L,加入96孔板,每孔 100 μ l,總反應體積 200 μ l。置 37℃,5%CO2孵箱培養 5天。于培養結束前4 h以淋巴細胞加培養液作為對照組進行混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction,MLR）。加入 MTT(5 g/L）20 μ l,37℃,5%CO2繼續孵育,4 h后棄去上清,加入DMSO 100 μ l,30 min后用酶標儀檢測波長在570 nm處的吸光度(A值）,增值活性以刺激指數(stimulate index,SI）表示:SI=實驗組A值/對照組A值。

1.3.7 致敏DCs誘導CTLs殺傷活性的檢測 將獲得的T淋巴細胞用完全培養基調細胞濃度為1×109/L,作為效應細胞。(1）CTLs殺傷活性的檢測:在96孔板中分別加入T淋巴細胞100 μ l(每孔1×105）,按照不同效靶比(80∶1、40∶1、20∶1、10∶1）加入SKOV3細胞,總反應體積200 μ l。在反應體系中分別加入 unpulsed-DCs、CpG ODN-pulsed-DCs、CpG ODN+TAA-pulsed-DCs、TAA-pulsed-DCs,每孔 1×104。每組設4個復孔,培養48 h,MTT比色試驗法測定各孔A值,單純效靶細胞共育作為對照。(2）CTLs特異性殺傷活性的檢測:在96孔板中分別加入T淋巴細胞100 μ l(每孔 2×105）,按照不同效靶比(80∶1、40∶1、20∶1、10∶1）分別加入 SKOV3 細胞 、Hela細胞和Lewis細胞,總反應體積200 μ l。在反應體系中加入CpG ODN+TAA-pulsed-DCs,每孔1×104,每組設 4個復孔,培養48 h,殺傷率按下列公式計算:殺傷率=100%×[1-(實驗組A值-效應細胞組A值）/靶細胞A值]。

1.4 統計學處理應用SPSS11.0軟件進行統計學分析,結果以(ˉx±s）表示,采用方差分析、LSD 檢驗等方法。

2 結果

2.1 ODN2006致敏DCs表型功能分析FACS測定結果顯示,培養72 h后CpG ODN-pulsed-DCs和CpG ODN+TAA-pulsed-DCs的表型發生明顯變化,其表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表達明顯上調,三者陽性細胞百分率均顯著高于unpulsed-DC組,而CD1α在各組間表達水平無明顯差別。致敏DCs培養上清中IL-12分泌水平測定結果顯示:unpulsed-DC組、TAA-pulsed-DC組培養上清液中IL-12的分泌水平為(60±9）ng/L和(86±13）ng/L,而在CpG ODN-pulsed-DC組和CpG ODN+TAA-pulsed-DC組培養上清液中IL-12水平顯著增加,分別為(375±32）ng/L和(437±65）ng/L,二者與 unpulsed-DC組和TAA-pulsed-DC組比較,差異均具有統計學意義(P＜0.01）。

2.3 ODN2006對DCs刺激T淋巴細胞增殖的影響各種致敏因素誘導的DCs均可不同程度地刺激T淋巴細胞的增殖,且隨著致敏DCs密度的增加,其T細胞的增殖活性逐漸增強。CpG ODN-pulsed-DC組和CpG ODN+TAA-pulsed-DC組在相同效靶比下對T淋巴細胞的刺激指數均無顯著性差異(P＞0.05）,但與unpulsed-DC組和TAA-pulsed-DC組相比,當T∶DC比值接近10∶1時,差異即有統計學意義(P＜0.01）,如表1所示。

表1 ODN2006致敏DCs對 T淋巴細胞增殖活性的影響(SI,±s）

表1 ODN2006致敏DCs對 T淋巴細胞增殖活性的影響(SI,±s）

注:相同T∶DC比值下,CpG ODN-pulsed-DC組與CpGODN+TAA-pulsed-DC組組間差異無統計學意義(P＞0.05）,*與unpulsed-DC組比較,P＜0.05,△與unpulsed-DC組比較,P＜0.01,#與TAA-pulsed-DC組比較,P＜0.01

組 別 孔數T∶DC 20∶1 10∶1 1∶1 unpulsed-DC 6 1.07±0.41 1.14±0.50 1.10±0.26 CpG ODN-pulsed-DC 6 1.60±0.28△ 3.12±0.57△# 3.87±0.91△#CpGODN+TAA-pulsed-DC 6 1.81±0.54△# 3.56±0.79△# 4.50.±0.65△#TAA-pulsed-DC 6 1.26±0.37 1.52±0.29* 1.51±0.43*F值 9.402 13.196 24.732 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.4 CTLs對SKOV3卵巢癌細胞的殺傷活性通過測定各組致敏DCs誘導的CTLs對SKOV3卵巢癌細胞的殺傷活性,結果顯示:CpG ODN+TAA-pulsed-DC組可增強CTLs對SKOV3細胞的殺傷能力,相同效靶比下與 unpulsed-DC組、CpG ODN-pulsed-DC組和CA125-pulsed-DC組相比差異均具有統計學意義(P＜0.01）。當效靶比低至20∶1時即呈現對腫瘤細胞的殺傷活性,且隨效靶比的升高,殺傷活性逐漸增強,殺傷率最高達56.1%,如表2所示。為進一步證實ODN2006聯合TAA致敏DCs所誘導的CTLs對SKOV3細胞具有特異性殺傷活性,我們測定了不同效靶比下CpG ODN+TAA-pulsed-DC所誘導的CTLs對不同腫瘤細胞的殺傷率。結果顯示,該種致敏方式能誘導T淋巴細胞產生對SKOV3細胞的特異性殺傷,而對Hela細胞和Lewis細胞無明顯殺傷活性。

表2 CTLs殺傷SKOV3卵巢癌細胞的活性比較(%,±s）

表2 CTLs殺傷SKOV3卵巢癌細胞的活性比較(%,±s）

注:相同效靶比下比較,*與unpulsed-DC組比較,P＜0.01,△與TAA-pulsed-DC組比較,P＜0.01,#與CpG ODN-pulsed-DC組比較,P＜0.01

組別 孔數效靶比10∶1 20∶1 40∶1 80∶1 unpulsed-DC 5 8.6±1.9 11.7±5.8 11.0±7.2 13.1±8.6 CpG ODN-pulsed-DC 5 10.3±3.7 15.0±3.9 23.9.±8.5*△ 29.7±14.3*△CpGODN+T AA-pulsed-DC 5 13.2±6.4* 24.7±9.0*△# 40.5±11.6*△# 43.9±10.8*△#TAA-pulsed-DC 5 10.8±5.2 13.2±7.1 14.5±9.7 16.2±6.3*F值 18.930 39.161 31.852 34.892 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

3.1 樹突狀細胞作為機體內最主要的專職抗原呈遞細胞(APC）在細胞免疫應答中起著不可替代的作用,其分化成熟與否直接關系到能否產生有效的抗腫瘤免疫效應。然而,經研究發現正常情況下體內大多數DCs都處于非成熟狀態,表達低水平共刺激分子和粘附分子,體外激發MLR能力較弱。因而在試圖應用DCs進行腫瘤免疫靶向治療的研究中急需一種可有效激活DCs、促使DCs由非成熟狀態轉變為成熟狀態的免疫佐劑。近年來研究顯示,人工模擬細菌基因組DNA合成的CpG ODN,因其含有非甲基化的CpG基序,可以通過與細胞內內質網膜上的Toll樣受體-9(Toll-like receptors,TLR-9）結合,誘導多種免疫細胞特別是B細胞、pre-DC2的活化、增殖和分化,誘導多種細胞因子的產生[2]。本研究直接向外周血來源的DCs培養環境中加入了ODN2006,分析比較其對DCs表面共刺激分子及培養上清液中IL-12分泌水平的影響,發現添加ODN2006后,表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表達均顯著增高,培養上清液中的IL-12分泌水平也較未刺激組有大幅度的升高,聯合加入TAA后這種刺激作用進一步增強,說明ODN2006可有效誘導DCs的成熟,促進DCs表達協同共刺激分子,其與TAA聯合應用能夠產生協同作用。

3.2 以往的實驗研究發現,許多合成的多肽疫苗可以引起較強的T淋巴細胞反應,但是對于已經存在的腫瘤沒有明顯的殺傷活性,這主要是因為免疫系統很難將這些可溶性蛋白抗原交叉遞呈給細胞免疫系統。因此,選擇能夠增強交叉遞呈作用的免疫佐劑將無疑是抗腫瘤免疫的先決條件。本研究發現經ODN2006+TAA致敏后的DCs在同種MLR中均可刺激T淋巴細胞的大量增殖,與未致敏組和單純TAA致敏組相比有顯著性差異。有研究顯示,CpG ODN對純化的T細胞沒有刺激增殖能力,而體內應用CpG ODN除了能夠顯著活化CD8+記憶性T細胞外,對所有T細胞均有一定程度的活化,故推測這種刺激活性可能主要依賴于APC分泌的I型干擾素及IL-12。此外,有學者發現CpG ODN可通過非IFN-R途徑介導DCs分泌大量的I型干擾素。因此,結合本實驗的研究結果,我們推測CpG ODN可能通過促進DCs分泌I型干擾素和IL-12,進而增強DCs的抗原遞呈能力,誘導T淋巴細胞的活化與增殖。

3.3 研究表明,腫瘤細胞逃逸宿主免疫應答的主要原因在于腫瘤細胞自身具有的免疫原性較弱,不能激發機體有效的免疫反應,因而增加腫瘤疫苗免疫原性的凈效應就是要刺激宿主的免疫系統對腫瘤抗原產生有效的捕獲、加工和遞呈。本研究從凋亡的SKOV3卵巢癌細胞中提取腫瘤相關抗原,試圖通過此種聯合致敏方式獲得特異性的抗腫瘤免疫反應。經研究證實,我們選用的ODN2006與TAA聯合致敏DCs后可顯著增強CTLs對SKOV3細胞的免疫殺傷活性,殺傷率最高達 56.1%,同時對Hela細胞和Lewis細胞卻無明顯的殺傷活性,從而進一步說明這種聯合致敏方式所誘導的CTLs對靶細胞的殺傷具有抗原特異性。動物在體實驗顯示,經CpG ODN免疫后的小鼠能夠誘導產生Th1型免疫反應,并通過釋放細胞因子等激活抗原特異性CD8+T細胞,進而引起CD8+T細胞依賴性的細胞毒性反應[3-4]。國外有學者通過研究小鼠B16F1黑色素瘤模型發現,將CpG ODN與B16F1腫瘤細胞聯合免疫荷瘤小鼠,可誘導產生長期持續的CTLs反應,促使腫瘤消退,延長荷瘤小鼠的生存期[5]。綜上所述,我們推測CpG ODN可能通過增強DCs對腫瘤相關抗原的加工遞呈功能,通過致敏DCs分泌相關細胞因子等促進CTLs活化與增殖,進而誘導其產生對SKOV3卵巢癌細胞的特異性殺傷活性,這為體內應用CpG ODN和TAA進行抗卵巢癌免疫奠定了實驗基礎。

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