纖維環(huán)穿刺法在建立椎間盤退變動物模型的實驗研究

何 斌,楊 堅,彭方亮,李 鋒

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院同濟醫(yī)院骨科,湖北武漢 430030;2.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨科, 832008）

腰椎間盤突出癥是臨床上影響人類健康的常見病和多發(fā)病,其病因及發(fā)病機制尚不清楚,大量研究表明椎間盤退變是主要原因之一[1]。而建立一種可靠的腰椎間盤突出動物模型為反復探討及研究椎間盤退變的發(fā)病機制提供有利的條件進而發(fā)現(xiàn)有效的治療方法。目前常構建椎間盤退變動物模型主要有應力型椎間盤突出動物模型、脊柱不穩(wěn)導致椎間盤突出模型、纖維環(huán)切開法、纖維環(huán)穿刺法、終板損傷法、化學損傷型動物模型。近年來多人通過兔模型行纖維環(huán)針頭穿刺,導致纖維環(huán)結構破壞,可觀察到漸進性椎間盤退變征象,且重復性好、符合人類椎間盤退變的動物模型[2-4]。故本實驗擬通過18G穿刺針刺入纖維環(huán),破壞髓核組織,來建立動物椎間盤退變的模型,并通過X線、MRI檢查、免疫組化觀察椎間盤的細胞、基質(zhì)形態(tài)、細胞數(shù)目和椎間盤Ⅱ型膠原含量的改變,以進一步確定是否能用此種方法來建立動物椎間盤退變模型及其退變的程度。

1 資料與方法

1.1 一般資料

成年新西蘭大白兔24只,雌雄不限,體重2.2-2.6 kg,平均為2.35±0.24 kg。單籠飼養(yǎng),喂食普通兔飼料,充足飲水,保持動物房清潔、干燥、安靜、通風好及溫度適宜。納入標準:無明顯全身免疫性疾病和慢性疾病感染,并經(jīng)MRI檢查確認無脊柱及椎間盤病變。模型組和對照組:以各只兔子的L5-6椎間盤為模型組,以L4-5椎間盤為自身對照組。

1.2 實驗方法

用10%水合氯醛5 ml/kg耳緣靜脈注射麻醉,備皮、消毒、鋪巾,取左側(cè)臥位固定,采用腰椎右側(cè)前方入路,從右12肋骨底部到髂嵴之間做一切口,切開皮膚,筋膜,逐層鈍性分離,于骶棘肌和腹外斜肌交界處打開腰背筋膜后層,分離腹外斜肌和后腹膜到橫突,使用銳性加鈍性剝離椎前軟組織,暴露脊柱的右前外側(cè)。以持針器夾持18G皮膚穿刺針頭,尖端保留約5 mm長度,于纖維環(huán)前外側(cè)方平行終板方向穿刺L5/6椎間盤(兔的腰數(shù)為7節(jié)）,刺入后維持5秒,然后拔除穿刺針,遂層縫合,關閉切口,敷以紗布,并給予慶大霉素8萬單位肌肉注射。麻醉及術中兔子均無死亡。術后2-3小時兔子麻醉清醒,活動。當天兔即可進食,次日排便,4日后活動好。術后將動物隨機分為4、8、4周3個模型組,每組8只,分籠飼養(yǎng)。分別在術后1周、2周、4周作X線和MRI檢查后靜脈注入空氣致死。并取出L5-6髓核標本。置于10%甲醛溶液中,固定24小時后,制作石蠟切片,并同時取L4-5椎間盤組織作為對照組。

1.3 檢測指標

1.3.1 X線檢查 分別于術后1周、2周、4周行 X線檢查。用Simens公司X線光機進行全脊柱正、側(cè)位X線片,觀察腰椎椎間隙狹窄退變征象,在顯示器亮度、色度、對比度及清晰度恒定的條件下測量L4-5、L5-6椎間隙高度值,并求得模型組術前與術后高度值比、對照組術前與術后高度值比。

1.3.2 MRI檢查 分別于術后1周、2周、4周行MRI檢查。采用Simens公司1.5T超導型核磁共振掃描儀(MRI）檢查。用自旋回波序列對腰椎行矢狀位掃描和L1-S1椎間盤橫軸位掃描,序列重復時間/回波時間T1加權像為 5000/96 ms,T2加權像為5 000/128 ms,層厚3 mm,層間距1 mm,觀察椎間盤信號的改變。由放射科醫(yī)生盲法閱片后診斷結果。將術后各階段的成像結果進行影像資料的測量與分析L3-4、L4-5、L5-6整個椎間盤和其內(nèi)呈高信號區(qū)域信號值。隨機選取圖像,每幅選取的圖像均反復測量三次并取平均值,得到對照組、轉(zhuǎn)染組和生理鹽水組術前與術后信號值比。

1.3.3 Ⅱ型膠原免疫組化染色方法及步驟(SP法）實驗標本制備成石蠟后,脫蠟、水化,用SP法發(fā)做Ⅱ型膠原免疫組化染色,脫水、透明、封片,顯微鏡觀察結果。結果進行統(tǒng)計學分析。

1.3.4 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。統(tǒng)計X線、MRI椎間隙高度的術前與術后高度值比在手術組和對照組間行t檢驗、方差分析。Ⅱ型膠原各周組內(nèi)模型組與對照組之間計量資料使用均數(shù)±標準差,數(shù)據(jù)行單因素方差分析,再兩兩比較使用t檢驗,P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 X線影像學檢查結果

術后1周、2周和4周,對照組腰段脊柱僅有2例椎間盤軟骨終板鈣化,1例椎間隙偶有輕微楔形樣變,無狹窄及骨贅形成,而模型組在多個椎間盤觀察到椎間隙楔形樣變,椎間隙狹窄及骨贅形成嚴重。對L4-5、L5-6椎間隙高度前后高度比值比較的結果見表1和圖1,每組動物有8只共24個椎體,樣本量為24。可見模型組和對照組椎間隙高度值比在1周、2周和4周明顯減低,呈進行性下降,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）,模型組椎間隙的降低程度隨時間的延長這種變化有加重表現(xiàn),差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）,對不同時期椎間隙高度值比的比較用配對t檢驗,模型組椎間隙高度于術后明顯減低,而P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

表1 模型組和對照組X線片椎間隙高度比值的比較(x-±s,n=24）

2.2 MRI影像學檢查結果

術后1、2和4周兔腰椎MRI上可見,模型組髓核信號強度呈逐漸減弱趨勢,椎間隙高度也有所下降,而對照組髓核信號強度基本無明顯改變(結果見表2,圖2）,說明髓核信號強度在模型組和對照組之間存在明顯差異,(P＜0.01）,且其下降與造模后時間的長短有顯著的關系,即造模后時間愈長,造模組髓核信號強度降低愈明顯。

圖1 模型組不同時期的X線圖

表2 模型組和對照組MRI髓核信號強度的比較(x-±s,n=30）

圖2 模型組不同時期的MRI圖

2.3 免疫組化實驗檢測Ⅱ型膠原的表達

對照組(L4-5）組織基質(zhì)呈強陽性染色,1周、2周、4周模型組(L5-6）組織基質(zhì)分別呈弱陽性染色。測得1周、2周、4周Ⅱ型膠原表達經(jīng)圖象分析儀半定量測定(結果見表3）,采用t檢驗,說明髓核信號強度在針刺法破壞纖維環(huán)后染色程度明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義,髓核信號強度下降與造模后時間的長短有顯著的關系,即造模后時間愈長,造模組髓核信號強度降低愈明顯。

表3 在對照組和對照組中Ⅱ型膠原蛋白的表達(x-±s,n=30）

3 討論

人類腰椎間盤退變一直是人類研究的重點和熱點,目前引起椎間盤退變的確切機制尚無定論。椎間盤退變起源于髓核、軟骨終板和纖維環(huán)退變。髓核退變包括髓核細胞退變和髓核細胞外基質(zhì)退變。學者們通過可重復性的實驗動物,實施多種實驗方法,可大大縮短實驗周期,并為人們提供了一個研究的平臺→有效治療和預防椎間盤退變。人類疾病的動物模型(animal model of human disease）是指各種醫(yī)學科學研究中建立的具有人類疾病模擬表現(xiàn)的動物。本課題的動物模型是指通過實驗干預或自發(fā)過程,在實驗動物活體內(nèi)或體外模擬并觀察分析椎間盤退變的過程。從而為椎間盤退變的病因?qū)W研究提供參考依據(jù),進而對椎間盤退變的可能治療方法或藥物進行評估。

人類各種疾病的發(fā)生發(fā)展是十分復雜的,使用動物模型是現(xiàn)代生物醫(yī)學研究中的一個極為重要的實驗方法和手段,有助于更方便地認識人類疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和研究防治措施。自Lob(1933）首次通過手術直接采用纖維環(huán)切開等方式制成羊椎間盤退變模型后,不同方法和不同物種的退變模型相繼建立[5],靈長類、豬、犬等大型哺乳動物因動物實驗倫理和經(jīng)濟因素等條件限制而難以大量應用[6,7],兔和鼠仍作為構建椎間盤退變模型的常規(guī)實驗動物。本次動物模型的建立,選擇兔作為動物模型,具有經(jīng)濟、便利的特點,比大鼠更易獲取椎間盤及分離髓核組織、更能耐受手術創(chuàng)傷[8]。

本實驗X線觀察椎間隙變窄,椎體結構不穩(wěn),椎間盤上下軟骨終板有不同程度的鈣化,椎間隙狹窄嚴重,其模型組的椎間隙高度術前與術后比值明顯低于對照組的高度值比,行統(tǒng)計學分析,其術后1周、2周和4周的差異均具有統(tǒng)計學意義,且模型組椎間隙的降低程度隨時間的延長這種變化有加重表現(xiàn)。與相關文獻認為X線片能夠提供椎間盤高度降低、骨贅形成及椎間盤鈣化等病變信息,其中椎間盤高度是定量分析椎間盤退變程度與相關文獻相符[9]。MRI掃描已是椎間盤退變最簡單最精確的檢查手段,能在早期發(fā)現(xiàn)椎間盤退變。MRI的信號強度隨著椎間盤組織含水量呈正相關。本研究顯示術后1、2和4周模型組髓核MRI信號強度呈逐漸減弱趨勢,椎間隙高度也有所下降,而對照組髓核信號強度基本無明顯改變,其差異經(jīng)統(tǒng)計學分析有統(tǒng)計學意義,也隨時間呈逐漸加重。有研究顯示椎間盤退變,主要表現(xiàn)在椎間盤干癟、變薄,髓核中心不同程度的纖維化、鈣化、髓核嚴重皺縮。本實驗中纖維環(huán)穿刺組術后MRI檢查,椎間隙開始變窄,代表含水量的T2信號強度減弱并有椎間隙狹窄。椎間盤MRI圖像可作為椎間盤退變非常有價值、客觀的診斷依據(jù)之一[10]。

綜上所述,盡管損傷所誘導的椎間盤退變動物模型,在發(fā)病機制上與人類椎間盤退行性變尚有一定差異,但過這個方法制成的兔椎間盤退變模型與人類具有相同的生化及病理過程,可以作為椎間盤退變研究的動物模型,仍可為該類研究提供相關研究的實驗載體。相關研究顯示當椎間盤發(fā)生退變時,整個椎間盤的Ⅱ型膠原一直下降,這是一個總的趨勢,此改變與椎間盤退變程度呈正相關[11]。

本研究認為對照組(L4-5）組織基質(zhì)呈強陽性染色,1周、2周、4周實驗組(L5-6）組織基質(zhì)分別呈弱陽性染色,經(jīng)圖象分析儀半定量測定并分析,說明髓核信號強度在針刺法破壞纖維環(huán)后染色程度明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義,髓核信號強度下降與造模后時間的長短有顯著的關系,即造模后時間愈長,造模組髓核信號強度降低愈明顯。原因可能是髓核組織中Ⅱ型膠原的含量逐漸減少,隨著Ⅱ型膠原的減少,使椎間盤組織硬度增加,失去均勻傳遞壓力的作用,從而反復主要作用于某個點,使得纖維環(huán)薄弱處受力增加,易使該處纖維環(huán)破裂、變性髓核脫出。綜上所述,本實驗通過纖維環(huán)穿刺法成功誘導兔腰椎間盤的退變,這種退變可隨時間延長呈現(xiàn)進行性加重的過程,完全符合人類椎間盤的演變過程。本研究認為大白兔可作為椎間盤退變研究的動物模型,并為椎間盤退變研究提供大樣本的實驗可能。

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