596例壯族人群β-地中海貧血基因突變類型分析

覃志堅(jiān),龍顯科,王俊利,何印蕾,常正義

(右江民族醫(yī)學(xué)院,廣西 百色市 533000）

地中海貧血是一種常見的遺傳性血液病之一,其特點(diǎn)是因珠蛋白基因突變使血紅蛋白中珠蛋白鏈合成障礙,導(dǎo)致血紅蛋白成分組成結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,臨床上以慢性進(jìn)行性溶血性貧血為主要表現(xiàn)。大部分患兒因輸血并發(fā)癥或嚴(yán)重貧血死于成年之前,目前全世界已發(fā)現(xiàn)了200余種β珠蛋白基因突變類型,中國(guó)人中發(fā)現(xiàn)了30種[1]。百色是β-地中海貧血病的高發(fā)地區(qū),孕婦檢出率達(dá)6.74%[2],其基因類型及頻率分布具有明顯的地域及民族差異,本文對(duì)百色地區(qū)右江流域世居壯族進(jìn)行了β-地中海貧血的研究,從596例壯族地貧基因攜帶者中進(jìn)行β珠蛋白基因類型及頻率分布分析。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

為右江醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科2005年至2010年間當(dāng)?shù)貕炎寰驮\者,經(jīng)抗堿血紅蛋白(HbF）和血紅蛋白A(HbA）定量測(cè)定篩查檢出596名地貧基因攜帶者.男275名,女321名.年齡1d-75歲。祖籍及民族通婚情況均為純正壯族樣本。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 儀器 實(shí)時(shí)熒光PCR分析系統(tǒng)由匹基生物公司提供;β-地中海貧血芯片檢測(cè)閱讀系統(tǒng)亞能生物有限公司提供。

1.2.2 試劑 PCR試劑盒及反向點(diǎn)雜交(RDB）β-地中海貧血的基因診斷試劑盒由亞能生物有限公司提供。按操作說明書進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血液標(biāo)本的采集和保存 抽取靜脈血5 ml,EDTA-Na2抗凝,分離血漿與血細(xì)胞,-85℃存放。

1.3.2 β地中海貧血初篩 用醋纖薄膜對(duì)血紅蛋白液進(jìn)行電泳分離、721分光光度計(jì)比色測(cè)定HbA2含量,用抗堿法測(cè)定HbF含量。[3]

1.3.3 外周血DNA提取 篩查出的陽性標(biāo)本按常規(guī)的酚—氯仿抽提法提取DNA。

1.3.4 β珠蛋白基因突變分析[4]PCR擴(kuò)增β珠蛋白基因:引物的5末端用生物素標(biāo)記.與酶標(biāo)抗生物素蛋白相結(jié)合作為檢測(cè)信號(hào)。長(zhǎng)片段引物:Long fragment primer 600 bp擴(kuò)增片段Amplified fragment,C1:5′-GTA CGG CTG TCA TCA CTT AGA CCT CA-3′,C2:5′-TGC AGC TTG TCA CAG TGC AGC TCA CT-3′,短片段引物:Interest paragraph primer 200 bp擴(kuò)增片段 Amplified fragment,D5:5′-CAA TGT ATC ATG CCT CTT TGC A-3′,D6:5′-GAA TAA TCC AGC CTT ATC CCA A-3′

(1）基因組DNA提取:檸檬酸鈉抗凝全血2 ml,分離血漿與血細(xì)胞,-85℃存放,外周血DNA提取篩查出的陽性標(biāo)本采用常規(guī)酚—氯仿抽提法抽提基因組DNA。(2）基因組DNAPCR:分別加入45 μ l PCR反應(yīng)混合物至含有擴(kuò)增所需的DNA多聚酶各管中;吸取2 μ l處理樣本上清液至PCR反應(yīng)管中,混勻,5 000 r/min離心30 s。按下列參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng):94℃5 min(94℃60 s,55℃30 s,72℃60 s）×35個(gè)循環(huán),72℃5 min。(3）雜交[5,6].取15 ml塑料離心管,編號(hào),放入同樣標(biāo)有編號(hào)的膜條,加入A液(2×SSC,0.1%SDS,pH 7.4）12ml,加入1支PCR產(chǎn)物,擰上離心管蓋。沸水中加熱10 min,取出,放入42℃雜交箱或水浴箱雜交(雜交時(shí)間應(yīng)長(zhǎng)于2 h）,同時(shí)取1只50 ml塑料管,加入40 ml B液(0.5×SSC,0.1%SDS,pH 7.4）,擰緊蓋子,一并置于42℃雜交箱或水浴箱中進(jìn)行預(yù)熱(至少0.5 h）。(4）洗膜取出膜條,移至裝有預(yù)熱B液的50 ml管中,于42℃輕搖洗滌30 min(每管40 ml溶液）。(5）顯色:用鑷子小心取出膜條,用A液在平皿中室溫輕搖洗膜2次,每次5 min,再用C液(檸檬酸鈉14.7 g溶于450 ml純凈水,用鹽酸調(diào)pH值至5.0,最后定容至500 ml）室溫輕搖洗膜2次,每次2 min,將膜條浸泡于顯色液中避光顯色約10 min,將顯色的膜條在純水中快速漂洗1次,進(jìn)行結(jié)果判定。(6）雜交結(jié)果判定:正常的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只與正常寡核苷酸探針雜交,只在正常探針位置出現(xiàn)熒光信號(hào),突變的雜合子則與正常和相應(yīng)的突變探針雜交,在正常探針及突變探針位置均出現(xiàn)熒光信號(hào),突變的純合子或雙重雜合子只與相應(yīng)的突變探針雜交,在相應(yīng)的突變探針位置出現(xiàn)熒光信號(hào)。

檢測(cè)中國(guó)人7個(gè)常見β-地中海貧血基因突變位點(diǎn):CD41-42(-TCTT）,IVS-Ⅱ-654(C→T）,CD17(A→T）,-28(A →G）,CD71-72(+A）,CD17/-29。(6）結(jié)果判斷觀察膜條上出現(xiàn)的藍(lán)色斑點(diǎn),在野生型探針相應(yīng)的位點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)即為該位點(diǎn)的基因突變[7]。

2 結(jié)果

596例β-地貧攜帶者中,常見的基因突變位點(diǎn)為CD17 49.33%(294/596,其中純合子14例,雜合子206例,雙雜74例）;CD41-42 34.06%(203/596,其中純合子11例,雜合子130例,雙雜62例）;IVS-Ⅱ-654 8.39%(50/596,其中純合子1例,雜合子29例 ,雙雜 20例）;βE 8.05%(48/596,其中 βE雜合子32例 ,雙雜16 例）;CD71-72 4.36%(26/596,其中雜合子19例,雙雜7例）;-28 4.36%(26/596,其中雜合子16例,雙雜10例）;CD17/CD-29 0.17%(1/596）。頻率最高為CD17,其次為CD41-42,結(jié)果見表1。

表1 β-地中海貧血基因突變純合子、雜合子分布頻率[例(%）]

3 討論

地中海貧血是一種遺傳病,目前尚無良好的根治辦法,當(dāng)患者嚴(yán)重貧血時(shí),只能依賴長(zhǎng)期輸血和合理的除鐵方法維持生命,給家庭和社會(huì)造成極大的負(fù)擔(dān)。百色市地處廣西西部,人口378.8萬人(2006年統(tǒng)計(jì)）,壯族約占總?cè)丝诘?0%,瑤族、苗族、回族、彝族、仡佬族約占 6%。百色地區(qū)β-地中海貧血突變頻率與廣西省已有的研究資料接近,從地理分布上看廣西不同地區(qū)的β-地中海貧血基因型及其發(fā)病率多有差異.百色地區(qū)以CDl7最常見,其余地區(qū)則是CD4l-42最多見[8].吳惠珍等對(duì)百色市孕婦地中海貧血的篩查結(jié)果顯示,α-和β-地貧的總攜帶率為18.15%,其中α-地中海貧血雜合子為 11.41%,β-地中海貧血為6.74%。與報(bào)道的廣西南寧地區(qū)及柳州市隨機(jī)人群篩查的結(jié)果近似,比廣東省高[2]

本研究運(yùn)用基因芯片技術(shù),完成了596例壯族人群β-地貧基因攜帶者的珠蛋白基因突變分析,共檢測(cè)到7種常見突變類型。頻率最高為CD17,其次為CD41-42,有別于作者前一研究論文結(jié)果(CD41-42 46.20%、CD17 29.35%）[3],因前一篇論文研究對(duì)象為整個(gè)區(qū)域,不分民族,本文主要對(duì)象為壯族人群,與王報(bào)道的相符[8]。吳曉黎等[9]對(duì)貴州省苗族、水族、瑤族中的基因突變型特點(diǎn)、基因型頻率及分布規(guī)律研究中發(fā)現(xiàn),受檢2566人群中,共檢出134例β-地中海貧血攜帶者,總檢出率為51.22%,其中苗族、水族、瑤族檢出率分別為41.72%,61.06%,41.45%。經(jīng)β珠蛋白突變基因分析,在這3個(gè)民族中僅檢出兩種中國(guó)人常見突變型CD41-42和CD17,檢出率分別為88.11%,60.10%,23%。單可人等研究結(jié)果也顯示侗族人群中只檢出CD17(77%）、CD41-42(23%）兩種基因突變類型,而在土家族人群中檢出 CD17(23.1%）、CD41-42(69.2%）、卻有別于貴陽地區(qū)和前人報(bào)道的貴州β-地中海貧血基因突變類型情況[10],李毅等在瑤族同胞β-地中海貧血受檢的26例攜帶者中,經(jīng)PCR-RDB檢出CD41-42突變1例、CD17突變6例,結(jié)論為荔波瑤族人群中β珠蛋白基因變異情況很單一,很有自己獨(dú)特的特點(diǎn)[11]。提示基因突變類型具有顯著的民族特征。

[1]姚葉林,王樹勝,何英愛.東莞地區(qū)119例α-與β-地中海貧血基因突變類型分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2006,27(12）:1079.

[2]吳惠珍,常正義,韋鳳蓮,等.百色地區(qū)孕婦地中海貧血的產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2007,15(2）:50.

[3]單可人.貴州黔西荔波少數(shù)民族全血DNA提取方法的探討[J].貴州醫(yī)藥,2003,27(11）:976.

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[10]單可人,謝 淵,馬 嬌,等.貴州從江侗族和江口土家族人群β-地中海貧血基因突變型的研究[J].中國(guó)地方病學(xué)雜志,2005,24(5）:526.

[11]李 毅,單可人,趙 艷,等.貴州荔波瑤族β-地中海貧血篩查及基因分析[J].中國(guó)地方病學(xué)雜志,2005,24(2）:194.