長春地區RhD(-）基因型分析

于曉麗,焦立新

(長春市中心血站,吉林 長春 130033）

Rh血型是目前被國際輸血協會(ISBT）認定的29個紅細胞血型系統中最具復雜性和多態性的血型系統,它是繼ABO血型發現后臨床意義最大的一個血型。主要抗原有D、C、c、E、e,其中D 抗原具有高度免疫原性,最具臨床意義[1]。

1 資料與方法

1.1 對象長春地區隨機抽取Rh陰性獻血者血樣60名。

1.2 間接抗人球試驗確認RhD(-）血液

將60名陰性獻血者的血樣編號1-60,將其洗滌三次后配成5%紅細胞懸液,各取1滴加入試管中,再向試管中加入2滴IgG的抗D試劑(上海血液生物醫藥有限公司）,37℃孵育30分鐘。孵育30分鐘后用生理鹽水反復洗滌3次。棄盡上清,再向試管中加入廣譜抗人球蛋白試劑(上海血液生物醫藥有限公司）,1000轉1分鐘離心,觀察結果,有凝集者為RhD(+）,無凝集者為RhD(-）[2]。

1.3 基因組DNA提取

使用invitrogen DNA Isolation Kit(invitrogen Corporation,Wisconisin,USA）Lot:038 Batch:46481,按照說明書流程操作,從全血中提取基因組DNA。

1.4 序列特異性引物PCR(sequence-specific primer polymerase chain reaction,PCR-SSP）-瓊脂糖凝膠電泳

1.4.1 2.5%瓊脂糖凝膠的準備 將2.5 g瓊脂糖加入100 ml×TBE溶液(Tis-硼酸鹽-EDTA溶液）,加熱直到形成均勻的凝膠溶液。再加入5 μ l EB,混合均勻。將混合好的凝膠溶液倒入凝膠槽內,插入電泳梳,待冷卻后拔出電泳梳備用。

1.4.2 序列特異性引物PCR 篩選RHD(-）血液標本基因型采用天津秀鵬生物科技有限公司生產的特異性引物(引物包被在引物板上）,特異性檢測RHD基因的第1、5、6、7外顯子和845A/G 和1227A/G等位基因。一份樣本檢測4個外顯子和4個等位基因。PCR反應體系總體積為50 μ l。含5 U Taq聚合酶(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）,200 μ mol/L dNTPs,模板 DNA 10 μ l(80-100 ng/μ l）。 在BIO-RAD iCycler DNA擴增儀96℃預變性2 min,隨后96℃變性20 s,64℃退火50 s,72℃延伸45 s共32個循環。擴增產物進行凝膠電泳分析。

1.5 分析擴增條帶

2 結果

2.1 間接抗人球蛋白實驗結果在60名Rh陰性獻血者中RhD(-）標本60例。

2.2 PCR-SSP結果在60例RhD(-）樣本中,1名為 DVIⅢ型 、5名為弱D15、7名為1227DEL、9名RHDCE(2-9）-D、38名為真正的RHD基因缺失(表1）。

表1 60例RhD(-）標本PCR擴增條帶分析

圖1 RHD基因外顯子和等位基因的PCR-SSP檢測結果

3 討論

Rh血型系統是能引起輸血反應和新生兒溶血反應的重要血型系統。其主要有D、C、c、E、e五種抗原,以D抗原為最強,往下依次是E、C、c、e[3]。起初基于白種人的研究認為,RhD(+）者紅細胞表面存在D抗原,而RhD(-）者紅細胞表面不存在D抗原。但后來的研究發現在非洲黑人、澳大利亞人、日本人中一些 RhD(-）者存在部分或完整的D抗原[4],它的產生涉及復雜的基因變化。這種含有極弱D抗原的RhD(-）血液輸注到真正RhD(-）即RHD基因缺失患者的體內就會導致其產生抗D抗體。當再次輸注這樣的血液后,就會產生嚴重的溶血性輸血反應。因此對其基因的變化及分布規律進行深入研究具有重要意義。

RH基因由RHD基因和RHCE基因兩個組成,它們各含有10個外顯子。RHD基因編碼D抗原,RHCE基因編碼C和E抗原。起初認為RhD(+）者攜帶 RHD基因和RHCE基因,而RhD(-）者只有RHCE基因而無RHD基因存在。但后來的研究發現一些東方人群中,RhD(-）者紅細胞表面存在部分或完整的RHD基因[5]。這種RhD變異體的形成涉及了復雜的分子生物學變化,主要為 RHD和RHCE等位基因發生融合、細胞外環錯義突變、外顯子缺失和等位基因被替換等機制[6-9]。經研究證明這些RhD的變異表型主要包括弱D、部分D和DEL型。在中國人群中,尤以弱D15、RHD-CE(2-9）-D、1227DEL較常見。國內外學者研究發現:利用12種單克隆抗體對2名弱D15的個體做抗原表位檢測,發現 5種克隆抗體顯現陰性反應,包括LHM174/102、LHM77/64、LHM70/45、LHM59/19、LHM57/17,這說明弱D15型人紅細胞表面存在第1、8、9抗原表位的缺失[10-11]。還有學者對弱D15型人的RHD基因的第6號外顯子進行研究,結果發現在6號外顯子上均存在堿基突變845G〉A,編碼序列其它部分與正常 RHD序列相同[5]。RHD-CE(2-9）-D主要是由于RHD基因的第2-9號外顯子被RHCE基因所替換,導致不能編碼正常的RhD蛋白,形成個體D抗原陰性表型[12]。DEL等位基因均是由1個核苷酸突變所引起的。DEL的遺傳背景在中國人和歐洲白人之間存在明顯差異。中國漢族人群中最為常見以及在過去很長時間的報道中表明中國漢族人群中只存在這種等位基因RHD1227A[13]。

60例RhD(-）樣本經PCR-SSP實驗共檢測出:1例DVIⅢ型、5例弱D15 、7例1227DEL、9例 RHDCE(2-9）-D、38例RHD基因缺失[即為真正的RhD(-）]。其中RHD基因缺失所占陰性血液比率的63.33%,長春與云南等地區RHD基因缺失所占陰性血液比率沒有顯著性差異(P＞0.05）;RHD-CE(2-9）-D型所占陰性血液比率的15%,與2002年和2003年國內學者檢測到的比率12%很接近[7,14]。說明這種表型的RhD(-）血液在國內還是比較常見的。1227DEL所占陰性血液比率的11.67%,與上海、新疆、日本地區比較無顯著性差異[15-16]。但是與臺灣、海南等地區差異較大[17-18]。基本接近于國內大部分地區。本實驗檢出1例DVIⅢ型,它形成的分子生物學機制是:RHD基因的第3-6號外顯子被RHCE基因所取代產生融合基因,使得D抗原表達很弱,很不易被檢出。此型一般多見于白種人和日本人,中國人群比較少見[1]。

由于目前RhD(-）基因變化尚處在研究階段,對于RhD(-）表型血液臨床應用還沒有具體定論。但RhD(-）表型血液在臨床有其重要意義。RhD(-）表型的血液一直被當作RhD(-）血使用。這種表型RhD(-）血液的輸注方式,對于真正的RhD(-）患者存在潛在的危險,因為這種血液紅細胞表面的極弱D抗原可能誘發RhD(-）患者產生抗D,從而增加溶血性輸血反應的發生率;對于RhD(-）女性患者,輸注這種血液,懷孕后發生新生兒溶血病的風險也隨之增大。另一方面,RhD(-）表型患者輸注真正的RhD(-）血則意味著血液資源的巨大浪費。因此,研究準確的RhD(-）基因的定型方法,對臨床輸血安全有重要意義。

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