高強度聚焦超聲結合微泡造影劑殺傷原頭蚴的效果*

孔 璟,葉 彬,2,張 靜,韓秀敏,楊永海,李發琪

2.重慶醫科大學分子醫學與腫瘤研究中心,重慶400016;

3.青海省地方病防治研究所,青海 811602;

4.重慶醫科大學醫學超聲工程研究所,重慶 400016

高強度聚焦超聲結合微泡造影劑殺傷原頭蚴的效果*

孔 璟1,葉 彬1,2,張 靜1,韓秀敏3,楊永海3,李發琪4

目的探討高強度聚焦超聲結合不同比例微泡造影劑對離體原頭蚴的殺傷效應。方法在原頭蚴懸液中加入不同比例的微泡造影劑(含氟脂質體微泡),以相同超聲功率及輻照時間作用(治療聲功率為50W,輻照時間為30s)。臺盼藍排斥試驗計數原頭蚴殺傷率,光鏡檢測原頭蚴形態結構變化。結果超聲劑量一定時,加入適宜比例的微泡造影劑組原頭蚴殺傷率比單純超聲輻照組高(P＜0.05);隨著微泡造影劑比例的增大,原頭蚴殺傷率呈增高趨勢;原頭蚴結構損傷嚴重,臺盼藍染色深,被膜皺縮體積變小,甚至被膜崩解成碎片,小鉤及鈣顆粒散在分布。結論 HIFU結合微泡造影劑能增強對離體原頭蚴的殺傷效應。

高強度聚焦超聲波;微泡造影劑;棘球蚴;原頭蚴

2.重慶醫科大學分子醫學與腫瘤研究中心,重慶400016;

3.青海省地方病防治研究所,青海 811602;

4.重慶醫科大學醫學超聲工程研究所,重慶 400016

細粒棘球蚴是細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus)的中絳期幼蟲,可寄生于人和多種食草家畜及其它動物,引起嚴重的人獸共患寄生蟲病,稱為囊性棘球蚴病(cyst echinococcosis),也稱包蟲病(hydatid disease)。該病呈世界性分布,在我國西部廣大畜牧業地區發病率較高,嚴重影響人畜健康和經濟發展[1]。棘球蚴內含數量不等的原頭蚴(protoscolex),每一個原頭蚴在終末宿主體內都能發育成一條成蟲,在中間宿主體內能發育成新的棘球蚴,加重對機體組織的破壞。因此,原頭蚴在細粒棘球絳蟲的整個生活循環過程中具有重要作用。殺滅原頭蚴,能中斷棘球蚴生活史,達到治療包蟲病的目的。

高強度聚焦超聲波(high intensity focused ultrasound,HIFU)是一種新型的微創甚至無創性治療技術,近年來,HIFU已廣泛應用于臨床實質性器官占位性腫瘤的治療[2]。本課題組研究證實HIFU殺傷棘球蚴具有肯定的效果,但使用一定范圍的超聲劑量并未將棘球蚴包囊內原頭節全部殺滅,HIFU治療效果尚有欠缺[3]。超聲造影劑(ultrasound contrast agent,UCA)是一種臨床用診斷試劑,內含微泡,也叫微泡造影劑(microbubble contrast agent,MBCA),在超聲作用下會被破壞。早期研究已經證實微泡破壞能降低超聲空化閾值,增強超聲對靶組織的生物學效應[4]。本實驗用 HIFU結合微泡造影劑殺傷原頭蚴,觀察不同濃度微泡造影劑經超聲作用后對原頭蚴的殺傷效應,并初步探討超聲結合微泡造影劑殺傷棘球蚴的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要儀器 JC-200型高強度聚焦超聲腫瘤治療系統由重慶醫科大學超聲工程研究所研發、提供。該系統主要包括超聲換能器、治療探頭、B超監控系統、機械運動控制系統、治療床等部分。超聲換能器能將電能轉換為聲能,通過凹透鏡聚焦原理,形成高能量聚焦點。系統參數設計如下:探頭直徑:150 mm,聚焦焦距為110 mm。額定輸出聲功率:250 W,連續可調。超聲換能器的工作頻率為1 000 MHz,實驗中均采用連續波。超聲換能器及治療探頭安裝于盛循環脫氣水的水囊底部,通過操作機械運動控制系統,能使換能器及治療探頭延X、Y、Z三個運動軸運動。超凈工作臺(上海博訊醫療設備公司)、其它儀器設備均由重慶醫科大學分子醫學與腫瘤研究中心及基礎醫學研究所提供。

1.1.2 主要試劑 微泡造影劑由重慶醫科大學附屬第二醫院超聲影像學研究所提供(自制含氟脂質體微泡,經第三軍醫大學鈷源輻照中心輻照消毒處理);0.01mol/L PBS溶液(武漢博士德公司);0.25%臺盼藍染液(臺盼藍為美國Gibco公司產品,以PBS溶液稀釋、過濾,終濃度為 0.25%);滅菌注射用生理鹽水及其它試劑均為國產。

1.1.3 棘球蚴標本 棘球蚴感染羊肝采自青海省西寧市某屠宰廠。

1.2 方法

1.2.1 原頭蚴懸液的制備 洗凈羊肝表面血跡,75%酒精擦消毒后置于超凈工作臺內,按無菌原則穿刺包囊,抽取原頭蚴和囊液收集于離心管中。待原頭蚴自然沉積后,小心吸取管底原頭蚴移入另一離心管中。肉眼見活原頭蚴呈細小白色沙粒狀,光鏡下見大多數活原頭蚴頂突和吸盤內陷,呈橢圓形,通體透亮,內部結構清晰完整,鈣顆粒清亮。0.25%臺盼藍染色,檢查原頭蚴活力。若拒染的活原頭蚴數量超過95%,即可用于實驗。將原頭蚴和囊液混勻成懸液,計數,調整原頭蚴密度約為4 000～5 000個/mL,分裝于無菌聚乙烯試管中,每管2 mL。

1.2.2 微泡造影劑的處理 將5 mL注射用生理鹽水注入微泡造影劑內,震搖20 s,使之充分溶解。溶解后的微泡混懸液呈米白色,微泡濃度約為1×109個/mL,微泡直徑 3.5～ 4.5 μ m,分布均勻。

1.2.3 實驗分組 將上述制備好的原頭蚴懸液分為4組。空白對照組:無任何干預措施;單純MBCA組:加入與原頭蚴懸液呈一定比例的造影劑懸液;單純HIFU組:給予高強度聚焦超聲進行輻照;HIFU結合MBCA組:加入與原頭蚴懸液呈不同比例的造影劑懸液。以上各組中每根試驗管設3個平行管,試驗隔天重復1次,共重復5次。

根據前期試驗結果,選擇致50%原頭蚴即刻死亡的HIFU劑量50W×30s作為本次試驗所用劑量,即治療超聲功率為50W,輻照時間為30s。試驗時,將裝有原頭節懸液的試管固定于治療探頭焦域內,管中液面沒入脫氣水液面下。聲波由治療探頭從脫氣水下向上發出,調整治療探頭位置,使焦點對準試管內懸液中心進行照射。

1.2.4 初步探索微泡造影劑與原頭蚴懸液的比例按照1.2.3中所述的分組進行實驗。單純MBCA組:加入的MBCA懸液與原頭蚴懸液之比為1∶2;HIFU聯合MBCA組:下設5個組,加入的MBCA懸液與原頭蚴懸液的比例依次為:1∶1000、1∶500、1∶100、1∶10、1∶2。

1.2.5 再次探討微泡造影劑與原頭蚴懸液的比例為了更進一步明確造影劑用量,再次進行前述試驗。單純MBCA組:加入的MBCA懸液與原頭蚴懸液之比為1∶10;HIFU聯合UCA組:下設6個組,加入的MBCA懸液與原頭蚴懸液的比例依次為 :1∶100、1∶80、1∶60、1∶40、1∶20、1∶10。

1.2.6 臺盼藍排斥試驗 照射后即刻將懸液輕輕混勻,取1滴原頭蚴懸液涂片,滴入1滴0.25%臺盼藍,混勻。染色2 min,低倍鏡下觀察原頭蚴形態及活力,計數。活原頭蚴拒染呈透明狀,偶見少數活力較強者收縮蠕動;死原頭蚴不能排斥染料而被染成藍色。每張玻片隨機計數200個原頭蚴,每根試管涂片3張,共600個原頭蚴,計數其中活原頭蚴數目。取每組中各平行試管中活原頭蚴計數值的平均值作為該組活原頭蚴的最終計數值,根據下面公式計算原頭蚴急性殺傷率:殺傷率=(1-實驗組活原頭蚴數/對照組活原頭蚴數)×100%。

1.3 統計學分析 所有數據均采用SPSS17.0進行統計學分析。實驗數據以(±s)表示,組間比較采用卡方檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 對原頭蚴的急性殺傷率 加入與原頭蚴懸液成不同比例的MBCA懸液對原頭蚴的急性殺傷率如表1、表2。試驗中觀察到:單純MBCA組對原頭蚴無明顯殺傷效應,殺傷率與對照組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。單純HIFU進行輻照時,對原頭蚴有一定的殺傷效應,殺傷率在50%左右,與對照組相比有明顯差異(P＜0.01),顯示高強度聚焦超聲能夠殺傷原頭蚴。加入MBCA懸液的比例較低(1∶1 000)時,對原頭蚴的殺傷效應無顯著影響,殺傷率與單純HIFU組相比無明顯差別(P＞0.05)。加入MBCA懸液的比例為1∶500時,對原頭蚴的殺傷效應有所增強,殺傷率與單純HIFU組相比差別有意義(P＜0.05)。MBCA懸液與原頭節懸液的比例為1∶100、1∶10時,對原頭蚴的殺傷效應明顯增強,殺傷率與單純HIFU組相比,差別較大且有統計學(P＜0.01)。加入足量MBCA懸液(1∶2)時,原頭蚴接近全部死亡。提示:MBCA懸液結合高強度聚焦超聲能增強對原頭蚴的殺傷效應,并且隨著MBCA懸液與原頭節懸液的比例的提高,對原頭蚴的殺傷率亦呈增強趨勢。根據表1的殺傷率結果,將MBCA 懸液的比例1∶100、1∶10作為進一步試驗的參數。

表1 HIFU結合不同比例微泡造影劑對原頭蚴的急性殺傷率(%)(±s)Tab.1 The dead rates of protoscolices treated with HIFU and MBCA in different setting proportions initially(±s)

表1 HIFU結合不同比例微泡造影劑對原頭蚴的急性殺傷率(%)(±s)Tab.1 The dead rates of protoscolices treated with HIFU and MBCA in different setting proportions initially(±s)

*:為無任何干預措施時,原頭蚴的自然死亡率。

分 組 活原頭蚴數 殺傷率(%)空白對照組 190±0.17 5.0±0.18*單純MBCA組 189.98±0.48 4.98±0.37單純HIFU組 99.03±2.57 50.23±1.89 HIFU聯合MBCA(1∶1000)98.36±3.64 49.98±2.37 HIFU聯合MBCA(1∶500)90.97±3.54 53.87±2.78 HIFU聯合MBCA(1∶100)49.51±2.13 74.67±1.92 HIFU聯合MBCA(1∶10) 38.82±1.03 80.45±0.68 HIFU聯合MBCA(1∶2) 2.86±1.6297.84±1.56

再次探索微泡造影劑懸液適宜比例的試驗中觀察到:比例為1∶80時,對原頭蚴的殺傷率最高,與比例為1∶100、1∶60時相比,差異有統計學意義(P＜0.05)。但與較高的比例1∶10時相比,兩者殺傷率差別不明顯(P＞0.05)。余下各組間相比,對原頭蚴的殺傷率差別均無統計學意義(P＞0.05)。

表2 HIFU再次結合不同比例微泡造影劑對原頭蚴的急性殺傷率(%)(±s)Tab.2 The dead rates of protoscolices treated with HIFUand MBCA in different setting proportions again(±s)

表2 HIFU再次結合不同比例微泡造影劑對原頭蚴的急性殺傷率(%)(±s)Tab.2 The dead rates of protoscolices treated with HIFUand MBCA in different setting proportions again(±s)

*:為無任何干預措施時,原頭蚴的自然死亡率。

分 組 活原頭蚴數 殺傷率(%)空白對照組 189.64±0.39 5.13±0.29*單純MBCA組 179.41±0.47 5.38±0.07單純HIFU組 92.10±3.25 50.77±2.30 HIFU聯合MBCA(1∶100)39.45±0.52 79.18±0.37 HIFU聯合MBCA(1∶80) 32.62±1.51 82.45±1.33 HIFU聯合MBCA(1∶60) 35.69±4.680.59±2.58 HIFU聯合MBCA(1∶40) 35.85±2.63 80.92±1.92 HIFU聯合MBCA(1∶20) 32.24±2.54 82.45±1.68 HIFU聯合MBCA(1∶10) 31.6±0.7783.16±0.56

2.2 對原頭蚴的形態觀察 普通光學顯微鏡下觀察。對照組與單純MBCA組:原頭蚴形態正常,臺盼藍拒染,體被膜完整,內部小鉤、鈣顆粒等結構清晰可見,排列有序(圖 1:A、B)。單純HIFU組:約50%原頭蚴死亡,臺盼藍著色,但未見被膜明顯破損,內部結構大致可以辨別,小鉤、鈣顆粒所處位置無明顯改變(圖1:C)。加入較低比例(1∶1000)的MBCA后,原頭蚴殺傷率、形態變化與單純HIFU組相比不明顯(圖1:D);隨著MBCA比例的增大(1∶500),原頭蚴殺傷率增加,部分原頭蚴變成圓形,體積縮小,臺盼藍染色較深,內部結構不清楚,但亦未見被膜結構明顯變化(圖1:E)。MBCA比例再增大(1∶80),絕大部分原頭蚴死亡,形態變圓體積縮小,深染色,部分死亡原頭蚴皺縮,形態不規則,內部結構無法清楚辨別(圖1:F)。MBCA比例為1∶10時,原頭蚴形態變化與1∶80時相比差別不明顯(圖1:G)。當MBCA與囊液比例足夠大(1∶2)時,原頭蚴幾乎全部死亡,體被膜完整性被破壞,有散在被膜碎片,可見大量散在的小鉤及鈣顆粒(圖1:H)。

3 討 論

圖1 不同比例MBCA對原頭蚴結構的影響(臺盼藍染色,×100)A:對照組:原頭蚴結構形態正常,臺盼藍拒染;B:單純M BCA組:與A組相比無差別;C:單純 HIFU組:約50%原頭蚴死亡,臺盼藍著色,形態結構基本正常(箭頭所示);D:MBCA與原頭蚴懸液比例為1∶1 000,原頭蚴死亡及形態變化與C組相比無明顯差別;E:MBCA與原頭蚴懸液比例為1∶500,原頭蚴縮小變圓,深染色,內部結構不清(箭頭所示);F:MBCA與原頭蚴懸液比例為1:80,原頭蚴深染色,部分皺縮(箭頭所示);G:MBCA與原頭蚴懸液比例為1∶10時,原頭蚴死亡及形態變化與C組相比無明顯差別;H:M BCA與原頭蚴懸液比例為1:2,見原頭蚴被膜碎片,小鉤、鈣顆粒散落(箭頭所示)。Fig.1 The influence of MBCA in various proportions on structures of protoscolices(trypan blue exclusion assay,×100)A:control,alive protoscolices were not stained in blue and their structures were clear.B:the protoscolices treated with MBCA alone,there was any difference compared with group A.C:the protoscolices treated with M BCA alone,the dead rate of protoscolices was 50%,dead protoscolices were stained blue and their structures were somewhat clear(shown as the arrow).D:the proportion of MBCA was 1:1000,the dead rate and structural changes of protoscolices was no difference compared with group C.E:the proportion of MBCA was 1:500,dead protoscolices rounded to smaller sizes,they were stained blue deeply and their structure inside were indistinct(shown as the arrow).F:the proportion of MBCA was 1:80,dead protoscolices were stained blue deeply,some of them shrinked(shown as the arrow).G:the proportion of MBCA was 1:10,the dead rate and structural changes of protoscolices was no difference compared with group F.H:the proportion of MBCA was 1:2,protoscolices were broken into pieces,the numerous hooklets and calcareous bodies were scatted(shown as the arrow)

HIFU是利用超聲波的組織穿透性、可聚焦性、能量沉積性等物理特性,將體外聲源發射的超聲能量聚焦在體內的病灶,比如腫瘤塊處,通過高強度超聲波在聚焦處產生的熱效應、空化效應、機械效應等生物學效應,損傷破壞靶組織結構,從而實現治療疾病的目的。研究表明,超聲不僅可以使細胞膜通透性增加,并且能誘導其凋亡和壞死[5],目前認為空化效應是主要作用機制。空化效應是指組織或液體中的微小氣泡核在超聲波作用下被激化,通過泡核的振蕩、膨脹、收縮等一系列動力學過程,把聲場能量高度集中于極小的空化泡內,并且在最后空化泡爆破瞬間把高能量釋放出來,同時伴隨瞬間放電、發光、沖擊波等物理和化學效應。空化效應釋放的這些高能量及伴隨的效應導致微氣泡周圍組織的細胞膜被擊穿,產生可逆或不可逆的小孔,使細胞膜通透性增加[6]。微泡造影劑是內含不同氣體的微氣泡,這些微氣泡能降低空化效應的閾值,增強超聲空化效應[4]。

研究認為,微泡造影劑增強HIFU空化效應的機制主要是:首先,超聲造影劑本身作為微小的氣泡,可以大大增加單位體積的靶組織內空化核的數量,增強空化起始效應,從而增強空化效應對靶組織的破壞作用[7]。劉玉鳳[8]等的研究發現,超聲介導造影劑聲諾維能促進體外培養的人臍靜脈血管內皮細胞凋亡,抑制其活性。其次,改變組織聲環境(changing acoustic environment in tissue,CAET)原理,即采用一些方法和措施來改變組織的結構、功能以及聲學特性,增加靶區聲阻抗值,使聲能在靶區組織中盡可能多的沉積[9]。肖雁冰[10]等的研究表明,將具備高聲阻抗特性的碘油造影劑注入實驗動物羊后,能在不切肋骨條件下增強HIFU對肝臟組織的損傷效果。

本試驗研究利用微泡造影劑的效應特點,首次將微泡造影劑引入 HIFU殺傷細粒棘球蚴的研究中,這是研究的創新點所在。微泡造影劑作為外源性空化核被人為加入原頭蚴懸液中,大大增加了懸液內空化核的數量和密度,增強超聲的空化效應;同時這些空化核也改變了原頭蚴懸液這一靶對象的聲學特性,增強其內部聲阻抗的不匹配性,利于超聲聲能在液體內盡可能多的沉積。通過這兩方面共同作用的結果,使HIFU對原頭蚴的殺傷效應增強。

試驗結果表明,單純以50W×30S的HIFU劑量作用原頭蚴懸液,對原頭蚴的急性殺傷率為50%左右,這與本課題組前期研究的結果一致,再次證實了HIFU對離體原頭蚴具有一定的殺傷效應。而僅加入微泡造影劑卻不進行超聲輻照,對原頭蚴殺傷率及形態結構改變沒有顯著影響,說明微泡造影劑只有經過超聲波激發,才能發揮其增效作用。在相同的超聲輻照條件下,加入較低比例(1∶1 000)的MBCA時,對原頭蚴的殺傷率、形態結構改變沒有顯著影響。分析原因,認為加入的MBCA比例低,人為引入的外源性空化核數量少,密度低;在相同體積的原頭蚴懸液中,每個空化核到作用目標原頭蚴的空間距離相對較遠,其經過超聲激發、崩潰瞬間產生的高能量、沖擊波等效應無法或較少波及原頭蚴。因此,對原頭蚴的殺傷率無明顯提高,亦未明顯改變原頭蚴形態。隨著MBCA比例的提高,仍使用相同超聲條件輻照,對原頭蚴的急性殺傷率呈增加趨勢,對原頭蚴形態結構的損傷也逐漸加重。這說明,HIFU聯合MBCA能增強對原頭蚴的急性殺傷效應。再次探討MBCA與原頭蚴懸液比例的試驗結果中,MBCA的比例為1∶80時,與MBCA比例為1∶100時相比,對原頭蚴的殺傷率有差別;但MBCA比例為1∶80與MBCA比例分別為1∶60、1∶40、1∶20甚至是 1∶10時相比,對原頭蚴殺傷率無顯著差別。究其原因,認為可能是MBCA與原頭蚴懸液比例介于1∶60到1∶10之間時,空化核數量和密度在相同體積的原頭蚴懸液內達到飽和,可能有部分空化核未能受超聲波激發而發揮作用,故對原頭蚴的殺傷率無明顯影響。從對機體病變周圍組織產生最小負損傷的角度考慮,將實現相同殺傷效應時所需的最小MBCA比例1∶80作為進一步試驗的參考條件。試驗中還發現,當加入的MBCA比例為1∶2時,對原頭蚴的急性殺傷率為97%左右,對原頭蚴形態結構破壞嚴重,被膜崩解成碎片,頭鉤、鈣顆粒四處散落。說明在相同輻照條件下,只要加入足夠多的MBCA,使空化核的數量、密度在相同體積的原頭蚴懸液中達到過飽和狀態,HIFU的空化效應得到增強,幾乎就能完全殺滅原頭蚴。但試驗中考慮到大劑量MBCA的副作用及安全性,故不采用1∶2這一MBCA比例作為進一步試驗的參數。

本研究證實高強度聚焦超聲結合微泡造影劑能增強對離體原頭蚴的殺傷效率,拓寬了高強度聚焦超聲結合微泡造影劑的的應用范圍,為包蟲病的治療開辟了新的路徑。但是,對于超聲結合微泡造影劑誘導原頭蚴死亡的分子機制還需進一步研究,以揭示超聲結合微泡造影劑作用的本質。同時,還應繼續探討高強度聚焦超聲輻照劑量、微泡造影劑濃度以及對原頭蚴殺傷之間的效應關系,以便優化治療參數組合,使既能產生最佳的生物學效應,也對機體病變周圍組織產生最小負損傷,從而為包蟲病的治療提供一種安全而又有效的方法。

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Effect of high intensity focused ultrasound onEchinococcus granulosusprotoscolices with the aid of microbubble contrast agent

KONG Jing1,YE Bin1,2,ZHANG Jing1,HAN Xiu-min3,YANG Yong-hai3,LI Fa-qi4
(1.Department of Pathogenic biology,Chongqing Medical University,Chongqing400016,China;
2.Research Center for Molecule Medicine and Tumor,Chongqing Medical University,Chongqing400016,China;
3.Institute for Endemic Disease Control,Qinghai Province,Qinghai,811602,China;
4.Institute of Ultrasound Engineering in Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing400016,China)

To investigate the protoscolicidal effects of high intensity focused ultrasound(HIFU)with the aid of microbubble contrast agent(MBCA)on the protoscolices ofE.granulosusin vitro.The different suspensions of protoscolices mixed with M BCA in different proportions were treated with HIFU under the condition of constant parameter of fixed sound intensity(50 Watt)and treatment time(30 seconds).The protoscolicidal effects of HIFU were investigated by the trypan blue exclusion assay,and the structural changes of protoscolices were observed by microscope.It was found that in the treated groups whose protoscolices suspensions were added in suitable proportions of MBCA,the dead rates of protoscolices treated with HIFU and MBCA were more than those in the groups treated with HIFU only(P＜0.05),and the dead rates of protoscolices were related to the dosage of M BCA in a manner of proportion-dependent.It was observed that the protoscolices treated with HIFU and MBCA were damaged,stained deeply,shrinked to smaller sizes,and some dead protoscolices were broken into pieces resulting of the scattered numerous hooklets and calcareous bodies.The trial suggested that the protoscolicidal effect of HIFU can be enhanced by adding of microbubble contrast agent to the hydatid fluids.

high intensity focused ultrasound;microbubble contrast agent;hydatid;protoscolex

R512.6

A

1002-2694(2011)08-0687-05

*國家自然科學基金(No:30972567)資助

葉彬,E,mail:yebina@sohu.com

1.重慶醫科大學病原生物學教研室,重慶 400016;

2011-03-19;

2011-05-27