分子信標實時熒光定量PCR構綿羊PrP基因質粒和標準曲線

王 川,吳 潤,李發弟,刁小龍,趙春林,王 芳

2.甘肅農業大學 動物科學技術學院,甘肅 730070;

3.甘肅中醫學院,甘肅 730070

傳染性海綿狀腦病(T ransmissible spongiform encephalopathies,TSEs)是由朊蛋白引起的人和動物的一組具有共同特征的慢性、漸進性及致死性中樞神經系統(CNS)疾病,主要包括人克雅氏病(CJD)和格斯綜合征(GSS)、瘋牛病(BSE)、羊癢病(Scrapie)和鹿慢性消耗性疾病(CWD)等[1]。朊蛋白(Prion protein,PrP)是由一種不含核酸僅由修飾蛋白組成的傳染性顆粒(PrPSc),正常的細胞型PrP(PrPC)經過一個轉譯后過程獲得高含量的β-折疊而轉變成PrPSc,這類特殊的朊蛋白是由哺乳動物正常染色體上的PrP基因所編碼[2]。PrPC與PrPSc氨基酸序列雖然完全一致,但二者構象不同。當宿主受PrPSc感染時,PrPC的一些α-螺旋轉變為β-片層,PrPC蛋白發生錯誤折疊,使其三維構象改變而引起致病性PrPSc的產生而發病[2-3]。PrPC對蛋白激酶K(PK)的消化作用很敏感,PrPSc對PK的消化作用較耐受[4],正常的朊蛋白(PrPC)不能引起神經退行性病變,雖然目前已經對許多組織的PrPm RNA行了檢測,但是對它的生物學功能還知之甚少,對PrP基因表達的機制尚不清楚。研究顯示:不同組織細胞朊蛋白的表達程度差異很大,在綿羊中樞神經系統和外周器官[5],牛的神經組織和淋巴結[6],金黃地鼠[7],綿羊大腦[3]以及雞的腦組織和其它器官[8-9]中的研究發現PrPm RNA在中樞神經系統和淋巴組織中有高表達,目前的研究中,對胃腸道PrP mRNA的表達水平尚未有闡述,鑒于此,檢測消化道中PrPmRNA的表達量對經口部途徑感染時了解朊蛋白進入胃腸道時發生了什么以及朊病毒在機體傳播的途徑是什么非常重要。

實時熒光定量PCR是一種可精準定量m RNA表達水平的方法,目前該方法已被廣泛應用于各個領域的基因 mRNA表達水平研究,在朊病毒研究領域該方法也被大量應用[5,10-12]。為了研究消化道中PrPm RNA的表達量表達水平在朊病毒機體傳播途徑中的作用,本文構建了分子信標熒光定量PCR方法檢測PrP基因的表達標準質粒及標準曲線,為闡釋羊癢病發生的分子機理奠定基礎,從而為進一步研究朊蛋白疾病的發病機理提供有力的工具。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣 選取3-4歲的雌性綿羊各四只,屠殺后分別采取大腦、小腦、腦干、丘腦、脊髓、舌、扁桃體、食管上皮、咽上皮、心、肝、脾、肺、腎、胰腺、瘤胃上皮、小腸上皮、直腸上皮、盲腸上皮、十二指腸上皮、回腸上皮、結腸上皮、空腸上皮、腹股溝淋巴結、腸淋巴結組織、下頜淋巴結、卵巢和子宮,樣品立即放入液氮中2h,然后轉入到-86℃超低溫冰箱內。

1.1.2 主要試劑和儀器 TRIZOL(Invitrogen公司)、反轉錄酶SSⅢ(Invitrogen)、2×QuantiFast Probe PCR master M ix(Q IAGEN)、質粒快速提取試劑盒(Qiagen)、瓊脂糖提取試劑盒(博大泰克),pGEM T-Easy Vector Systems(Promega),Prem ix Taq酶、dNTP、RNASEOUT Ribonuclease和DNase-I(TaKaRa),M yCyclerTM Thermal Cycler EN-61010(BIO-RDA laboratories,U.S.A),熒光定量 PCR儀MX3005P(Stratagene)、核酸蛋白檢測儀 GeneQuant 1300(GE,USA),GL-20G-Ⅱ型冷凍離心機。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 稱取 100mg肝臟組織,用 TRIZOL RNA提取試劑盒按照文獻[13]進行。提取的RNA用30μL DEPC處理的滅菌三蒸水溶解,-86℃保存備用。

1.2.2 組織總RNA的RT-PCR

1.2.2.1 引物設計 參照GenBank注冊的綿羊朊蛋白基因 序 列 AF195247、 AJ567986、AY350273、 AY350275、DQ 149332、DQ149443、DQ 149446、DQ 149481、 DQ149483、DQ149484、DQ149485、DQ149486 和 DQ149487,進行序列比對后用Primer Prem ier 5.0在綿羊PrP完整開放閱讀框(ORF)內針對包含136、154和171密碼子的片段設計引物。引物由Invitrogen公司合成。

上游引物 5′-AGCTGGAGCAGTGGTAGGG-3′

下游引物 5′-CATTATCTTGATGTCAGTTTCG-3′

上游引物位于PrP開放閱讀框+360～+378位,下游引物位于+606～+627位,預計可擴增PrP開放閱讀框+360～+627位約為268bp的目的DNA片段。

1.2.2.2 反轉錄合成 cDNA 取總 RNA(1μg/μL)2μL,加入O ligo(dT)18(50μmol/L)2μL、dNTPM ixture(10mmo l/L)2μL、DEPC處理滅菌三蒸水 7μL,瞬時離心后 65℃5min,冰浴 5min,然后加入 5×First-Strand Buffer 2μL,0.1mo l/L DTT 1μL,RNase 抑制劑(40U/μL)1μL,Super-ScriptTM Ⅲ Reverse Transcriptase(200 U/μL)1μL,DEPC處理滅菌三蒸水2μL,吹打混勻,瞬時離心后于 PCR儀上55℃1h,然后置70℃15m in終止反應。

1.2.2.3 RT-PCR 總體積 50μL,其中 Premix Taq 25.0μL 、cDNA 1.0μL、上下游引物各 1.0μL(10 pmo l/L)、ddH2O 22.0μL。反應條件為:94℃預變性 5 min;94℃30s、60℃30s、72℃ 30s,共 35個循環;72℃延伸 5m in。 PCR 擴增產物經1.5%L瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.2.3 重組標準品質粒制備

1.2.3.1 PCR產物純化與載體連接、轉化 割膠后按照博大泰克膠回收試劑盒說明對PCR擴增片段進行純化、回收。按照PGEM T-Easy Vector Systems試劑盒的說明書將純化產物與 PGEM T-easy載體連接,連接體系為10μL,其反應組分為:PGEM T-Easy Vector(50ng/5μL)、PCR純化產物1.5μL、T4 DNA 連接酶 1.0μL、滅菌三蒸水1.5μL,同時設定陰性和陽性對照。將連接體系置于4℃冰箱中過夜后加入到200μL感受態大腸桿菌DH 5α中熱擊轉化后,加入Amp-LB液體培養基活化1h,低速離心后涂于Amp+、XGal和IPTG處理的LB瓊脂平板上,37℃過夜培養后置4℃冰箱中4h。挑取單菌落白斑,在含有Am p的LB液體培養基37℃、200r/m in振蕩過夜培養。

1.2.3.2 重組質粒的提取和鑒定 按照質粒快速提取試劑盒的操作要求提取質粒,對提取的質粒DNA進行重組質粒PCR、酶切和PCR-SSCP分析,挑取陽性克隆測序。利用BioEdit軟件對序列分析,挑取ARQ質粒。

1.2.3.3 實時定量RT-PCR引物和探針設計 根據測序結果設計了引物和分子信標探針:

上游引物 :5′-TTTTGGCAATGACTATGAGGAC-3′

下游引物 :5′-CATTA TCTTGATGTCAGTTTCGG-3′分子信標探針:

5′FAM-CAGCGAACCAGAACAACTTTGTGCATGACTGTGCGCTG-dabcyl 3′。

1.2.3.4 重組質粒定量標準曲線的建立 測定陽性重組質粒的OD值,計算出拷貝數。將標準品重組質粒進行10倍系列稀釋,以系列稀釋的質粒為模板在MX3005P型實時熒光PCR儀上擴增。反應體系為 25μL,反應組分為:2×QuantiFast Probe PCR master M ix(QIAGEN)12.5μL,上下游引物各1.0μL(10pmol/L),分子信標 0.8μL(10pmol/L),質粒 DNA 1.0μL,水 8.7μL;反應條件 95℃預變性 2 min;94℃ 15s、51℃45s、72℃30s,共 40個循環,在退火后期收集熒光值。反應結束后,計算機自動得到標準曲線。

2 結 果

2.1 組織 RNA提取和目的基因片段的擴增 組織提取的總 RNA紫外分光OD260/OD280為1.8～2.0之間,電泳結果表明 RNA分子保持完整。經RT-PCR擴增,產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,獲得大約200 bp左右的目的條帶。序列測定表明,獲得的目的條帶同原始序列的同源性為100%。

2.2 標準模板的鑒定 對提取的質粒進行Eco RⅠ酶切,在pGEM T-Easy載體插入片段的兩側均有Eco R Ⅰ酶切位點,經酶切后,目的基因含插入片段的大小為 268 bp(圖 3-1和圖 3-2)。對質粒DNA進行 PCR-SSCP分析[14],對質粒 DNA進行序列測定后,用bioedit軟件分析測序結果,挑選出ARQ質粒,標準質粒構建成功。

2.3 定量標準曲線的構建 將重組標準品質粒測OD值定量后,對此質粒10倍系列稀釋,進行實時熒光定量PCR擴增反應,反應結束后系統根據熒光值的變化規律,自動生成起始模板數擴增反應的動力學曲線,見圖3。

圖1 陽性克隆的PCR鑒定1～4:陽性質粒 PCR擴增產物;5～6:陰性質粒 PCR擴增產物;M:DNA分子質量標準Fig.1 PCR identification of positive clones1-4:PCR p roduct o f positive p lasm ids;5-6:PCR product of negative p lasm ids;M:DNA Marker

2.4 標準回歸曲線的建立和回歸方程的設定 對重組質粒10倍倍比稀釋,實時熒光定量PCR擴增后,根據熒光值的變化規律,通過基線設定,系統自動生成。由回歸曲線看出,起始模板濃度與Ct值之間呈良好的線性關系,該標準曲線檢測的靈敏度為108～103個模板;通過對其回歸曲線進行分析,發現其相關性良好,相關系數r2=0.999,系統生成的回歸方程為:y=-0.3069x+12.269(圖4)。

3 討 論

實時熒光定量PCR可以通過標準曲線對未知模板進行定量分析[15-16],實現了PCR技術從定性到定量的飛躍[5]。該技術具有敏感性高、重復性好、耗時短、操作簡便和無污染等優點,解決了分子醫學、生物技術、微生物和診斷方面的 m RNA表達水平定量問題,因此成為人們基因定量檢測的首選方法[17]。分子信標技術是一種呈發夾結構的莖環狀雙標記寡核苷酸探針,環部與靶 DNA序列互補,為15～35 bp莖部是由互相配對的堿基組成,但與靶DNA 無序列同源性,約 8 bp在探針的5′端和 3′端分別標記熒光發射基團和熒光淬滅基團,當溶液中的模板與分子信標結合配對時,分子信標的構象改變成鏈狀使得熒光發射基團與淬滅基團分開,當熒光基團被激發時,就發出熒光信號,與探針互補的靶分子數量越多,熒光信號也就越強,從而實現了對目的基因的定量檢測[18]。

本研究中,用分子信標作為熒光染料對綿羊的中樞神經系統、外周器官和消化系統的PrP基因的表達進行定量,具有特異性強、靈敏度高和結果準確的特性,研究結果具有可比性和重復性,可用于統計學分析。本研究中的 Ct值相對固定,重復性好,以不同濃度標準品質粒DNA分別進行熒光定量PCR擴增,發現起始濃度越高,Ct值越小,即起始模板濃與Ct值之間呈良好的線性關系。利用已知起始拷貝數的標準品質粒可做出標準曲線,因此只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。本研究中,通過 10倍系列稀釋標準品質粒濃度所得到的Ct值繪制的標準曲線的相關系數高達0.999,能夠保證數據的精確性。根據回歸方程,可直接計算出各樣品模板的初始含量。本實驗成功構建了PrP標準曲線,為進一步測定綿羊體內各部位的PrPm RNA表達奠定了基礎。

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