Spoligotyping結合多位點PCR用于牛分枝桿菌卡介苗的快速鑒定*

張媛媛 ,黃明翔 ,趙秀芹,張麗水,劉志廣,萬康林

2.福建福州肺科醫院 福州350001

卡介苗(Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin,M.bovis BCG)是上世紀初期法國科學家Calmette和Guérin從牛乳中分離出的牛分枝桿菌(M ycobacterium bovis,M.bovis),經13年 230代的傳代培養制成的減毒活疫苗。我國從上世紀50年代開始新生兒接種卡介苗工作,是我國兒童計劃免疫中歷史最悠久、接種人數最多的疫苗之一。公認地,卡介苗可以有效地降低兒童原發性結核、結核性腦膜炎、粟粒型結核的發生,但是自2007年以來,我國有多篇文獻報道由于疫苗誤種或不規范接種導致的兒童卡介苗病[1-3],甚至導致兒童死亡[4]。但是,這些病例全部是由臨床癥狀和流行病學資料診斷的臨床卡介苗病例,缺乏實驗室證據支持。本研究采用傳統的細菌學菌種鑒定技術和兩種分子生物學技術對從臨床診斷的一例兒童全身播散性BCG病病例的分離的菌株進行了鑒定,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 結核分枝桿菌H 37Rv,牛分枝桿菌93006,田鼠分枝桿菌ATCC19422,非洲分枝桿菌ATCC25420,鳥分枝桿菌ATCC25291,胞內分枝桿菌 ATCC13950,恥垢分枝桿菌ATCC19420,為本實驗室保藏株;臨床分離菌株和注射用卡介苗均由福建省福州肺科醫院檢驗科提供。

1.2 臨床病例及其流行病學資料[4]由福建福州肺科醫院醫生根據患兒臨床癥狀、相關實驗室檢查,包括:淋巴穿刺液細菌培養,涂片顯微鏡檢查以及血常規檢測和影像學檢查等,做出疾病臨床診斷,流行病學資料通過詢問患兒家長收集。

1.3 鑒別培養基培養與藥敏試驗 以無菌手續研磨臨床分離菌株的菌塊,并稀釋成1mg/m L的菌懸液,分別接種于對硝基苯甲酸(4-Nitrobenzoic acid,PNB)培養基、噻吩-2'-羧酸肼(2-Thiophenecarboxylic acid hydrazide,TCH)培養基、含甘油的羅氏(L-J)雞蛋培養基以及吡嗪酰胺(Pyrazinam ide,PZA)藥敏培養基各6支,培養基制備方法參照《結核病診斷細菌學檢驗規程》[5]。分別置于25℃,42℃,37℃培養,每周觀察結果至少兩次,當培養基斜面上有肉眼可見菌落時,記錄結果;觀察8周仍無肉眼可見菌落的培養管記為培養陰性。

1.4 Spoligotyping[6-7]PCR擴增DR區,將 PCR產物與固定于Biodyne C膜上的43個寡核苷酸探針進行雜交,用CDP-star檢測,采集雜交信號,根據雜交信號的有無判定菌種類型。

1.5 多位點PCR[8]根據結核分枝桿菌核酸序列選擇七個在結核分枝桿菌復合體中分布具有差異的基因設計引物[8],選擇了一個分枝桿菌屬特異16srRNA編碼基因和六個結核分枝桿菌復合體(Mycobacterium tubercu losis Comp lex,M tbC)菌種間具有不同分布的基因片段,分別是:Rv0577,IS1561',Rv1510,Rv1970,Rv3877/8,Rv3120。采用CTAB法粗提分枝桿菌核酸做為PCR反應模板,94℃預變性5m in,94℃變性1m in,60℃退火1m in,72℃延伸1m in,30個循環,最后72℃延伸 10min,1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察PCR產物及其長度,以標準菌株作對照,進行結果判斷。

2 結 果

2.1 臨床診斷與流行病學資料 患兒于出生當日接種卡介苗,3月后發現左腋窩淋巴結腫大并化膿,局部穿刺膿液涂片檢抗酸桿菌(4+),培養出抗酸桿菌,無結核病接觸史,予3HRZ/9HR方案治療(方案說明:3、9為用藥月數,H為異煙肼Isoniazid,R為利福平Rifam picin,Z為吡嗪酰胺Pyrazinam ide),局部反復抽膿、異煙肼膿腔注射沖洗,愈合良好后出院。1年后因左腋下淋巴結膿腫復發,并出現全身感染癥狀,再次入院,臨床診斷為:全身播散性感染,全身多發結核性淋巴結炎,肺結核,伴病毒感染,免疫功能低下。

2.2 培養試驗 患兒淋巴穿刺液接種于普通L-J培養基,生長3周后,有肉眼可見菌落生長,分離株被命名為FJ07111。在37℃條件下,FJ07111在含甘油的L-J雞蛋培養基上和PZA培養基上生長良好,而PNB和TCH培養基上均不生長,25℃、42℃培養條件下均無菌落生長。見表1。其生長特性與牛分枝桿菌一致。

表1 FJ07111在不同培養條件下的生長結果Tab le1 The culture resu lt under different culture conditions of FJ07111

2.3 Spoligotyping FJ07111和福建BCG疫苗株(M.bovis BCG)所有43個位點的雜交結果完全一致,第39-43位點未檢測到雜交信號,而33～38位點檢測到雜交信號。陰性對照(無菌蒸餾水)無雜交點產生,其余結核分枝桿菌臨床分離菌株(Mycobacterium tuberculosis,M tb)均缺失第33,34號位點的雜交信號。見圖1。

2.4 多位點PCR PCR擴增結果可見結核分枝桿菌具有全部的七個基因,牛分枝桿菌缺失Rv1510、Rv1970和Rv3120,而 BCG在此基礎上還缺失了Rv3877/8,同樣地,田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌和非結核分枝桿菌也具有不同的PCR擴增圖譜,見圖2。

3 討 論

某些免疫抑制病人可由于接種卡介苗而感染卡介苗病,尤其是某些新生兒可因此發生嚴重的淋巴結結核,或者是全身性結核病[9-10]。為進一步區分,由BCG引起的結核病被統稱為BCG病[9-10]。但是由于卡介苗的生長特性與牛分枝桿菌非常相似[11],傳統的生化反應,培養特點,藥敏試驗均不能將它們加以區分,因此很多卡介苗病的確診缺乏實驗室證據。

傳統細菌學鑒定是我國《結核病細菌學檢驗規程》[5]上明確規定的M.bovis鑒定方法。本研究中,臨床分離菌株FJ07111在PNB和 TCH培養基上不生長,而在含有甘油的L-J雞蛋培養基和PZA的藥敏培養基上生長良好,這是因為M.bovis對PNB和TCH敏感,而對PZA天然耐藥,因此傳統的細菌學鑒定結果證明FJ07111是M.bovis,并且由于其在含有甘油的L-J培養基上生長良好提示它可能是M.bovisBCG。Spoligotyping是一種以PCR為基礎的方法,該方法穩定、敏感性好、特異性高,被廣泛地應用于結核分枝桿菌復合體菌株的株水平的鑒定[6-7]。大量的菌株鑒定結果證實所有的M.bovis和M.bovisBCG都缺乏39～43間隔區而含有33～38間隔區,因此可以從結核分枝桿菌復合群中分辨出M.bovis和M.bovis BCG,但這種方法還不能從M.bovis中區分M.bovisBCG[7]。而多位點PCR則是今年來發展起來的一種更為簡單快速的菌種鑒定方法[8]。比較基因組學研究結果揭示:RD 1區(regions of difference,RD)缺失被認為是M.bovis變異為M.bovis BCG過程中主要的衰變事件(attenuation event),因為所有的卡介苗菌株都具有這種缺失[12],這一位點就是本研究中的第6號引物所指向的位點,在注射用BCG和FJ07111中擴增結果均為陰性,而其他M tbC菌株中均為擴增陽性。在對長序列多態性(long sequence polymorphism s,LPs)的PCR分析中發現有些 RD位點對于一個M tbC菌株或其亞種是具有唯一性的(有或無),還有一些則是在 M tbC菌種中具有不同的分布[13]。我們的實驗結果與文獻報道完全一致,證實了這些位點的組合在M tbC菌種間確實具有很好的區分能力,而且這種方法在獲得純培養菌株之后,僅需數小時即可獲得結果,操作簡便、需要的儀器和試劑容易獲得,因此這種方法具有良好的實驗室應用前景。

本研究將傳統的細菌學菌株鑒定技術和分子生物學技術相結合,成功地將臨床分離M.bovis菌株鑒定為M.bovisBCG,不僅為臨床確診提供了直接證據,還為未來的實驗室檢測鑒定BCG提供了可靠的技術方案。研究結果提示傳統的細菌學菌株鑒定技術雖然耗時費力,但是它對于操作技術的要求不高,所需的實驗條件在一般的臨床實驗室都可達到,仍然是我國絕大部分臨床實驗室的主要鑒定方法。而分子生物學方法則具有快速、簡便、準確、敏感、特異的特點,但是正是由于其敏感度很高,極易由于交叉污染而產生假陽性結果,造成誤診,因此開展分子生物學技術的實驗室應該嚴格控制實驗流程。總之,設計合理的菌種鑒定分子生物學方法實驗流程,建立標準化操作步驟(Standard Operation Procedure,SOP),不僅為我們深入了解結核病的致病菌菌種類型提供了準確的方法,為臨床確診提供直接證據以指導臨床治療,還可以進行分子流行病學調查和研究,能夠為制定有效的控制和治療策略提供科學依據。

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