一例從人體分離的布魯菌的鑒定

李 翔，李 莉，程均福，李國明，崔步云

2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科，武漢430030；

3.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京10226

布魯氏菌病（布病）是由布魯氏菌（布氏菌）感染機體引起的人獸共患的自然疫源性疾病［1］。湖北省曾于上世紀90年代初對全省職業人群的布病疫情分布進行調查，血清學檢測結果顯示，荊州、孝感、襄樊和直轄市林區4地有布病感染者［2］；2007年，湖北省棗陽市疾病預防控制中心曾報道1例輸入性布魯氏菌病［3］，但上述均未得到病原學證實。2010年12月我們首次從1例疑似患者脊髓液中分離到1株疑似布魯氏菌菌株，對該菌株的種、型及生物學特性的研究對我省的布病防治工作具有重要的指導意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗菌株 從疑似患者體內用需氧培養管，全自動血培養儀分離菌株QTB1001，血平皿分離保存，該菌株在營養瓊脂上不生長，菌株由武漢同濟醫院檢驗科提供。

1.1.2 參考菌株 布魯氏菌標準菌株牛種菌544A、羊種菌16 M、豬種菌1330S及羊種M5疫苗株由中國疾病預防中心傳染病預防控制所（傳染病所）提供。

1.1.3 實驗試劑 布氏菌陽性血清；A、M因子血清；R型布氏菌血清；布氏菌噬菌體Tb和BK2；1∶5萬（20μg/mL）硫堇、堿性復紅染料紙片；硫化氫濾紙片；布氏瓊脂（美國BD公司）；TRANS 2x Easy Taq Super Mix（全式金生物技術有限公司）；QIA DNeasyblood＆Tissue kit（Qiagen公司）均由傳染病所提供。

1.1.4 擴增引物 以下引物均由上海生工生物工程公司合成

1.1.5 實驗儀器 Senso Quest labcycler PCR儀（圣歐國際有限公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌屬常規種型鑒定 硫化氫產生，硫堇、堿性復紅抑菌實驗，陽性血清、A、M 和R血清凝集實驗，布氏菌噬菌體裂解實驗，均參照衛生部疾病預防控制局編著《布魯氏菌病防治手冊》［4］。

1.2.2 模板制備 將實驗菌株和M5疫苗株分別接種布氏瓊脂平板，于37℃恒溫培養箱內孵育48 h，用PBS將細菌從平板上洗下，轉移到1.5 m L離心管內，在80℃恒溫水浴鍋中加熱30 min滅活后，用Qiagen公司的QIAgen DNeasy blood ＆tissue kit提取全基因組DNA，置于－20℃冰箱中保存備用。

1.2.3 PCR擴增體系 10μL 2×Easy Taq Super Mix，引物濃度均為20μmol/L，0.2μL B.melitensis，0.2μL IS711，0.2μL omp25－F，0.2μL omp25－R，DNA 模板0.3μL（或加入同體積的M5疫苗株DNA作為陽性對照），無菌水9.3 μL，終體積20μL。PCR擴增程序：94℃變性3 min；94℃30 s、58℃30 s、72℃30 s，擴增35個循環；72℃延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

2 結 果

2.1 菌落生長時間及形態觀察 劃線培養48 h后，布氏瓊脂培養基上可見直徑約1 mm圓形、濕潤、半透明的菌落，強光下呈油滴狀。涂片革蘭染色，鏡檢為革蘭陰性細小球桿菌。

2.2 布魯氏菌診斷血清凝集 用布氏菌陽性血清（1∶800）與菌株玻片凝集，呈陽性反應；粗糙（R）型布氏菌血清（1∶400）玻片凝集，呈陰性反應；A、M因子血清（1∶200）玻片凝集，均有凝集反應。初步判定為布魯氏菌，否定粗糙型、犬種和綿羊附睪種布氏菌。

2.3 布魯氏菌屬種型鑒定 用布氏菌的特異噬菌體Tb和BK2對菌株裂解實驗，100和104×RTB的Tb均不裂解被檢菌株，BK2能產生清晰的噬菌斑。結合2.1和2.2，被檢菌QTB1001各項鑒定結果符合羊種布魯氏菌3生物型。詳見表1、圖1。

2.4 AMOS－PCR鑒定結果 用布魯氏菌的特異性屬引物和種引物對布魯氏標準菌株M5疫苗株和被檢菌株提取的基因組DNA分別進行AMOSPCR擴增，結果均能擴增出特異性片段；特異性屬引物omp25擴增片段大小為490 bp，特異性種引物擴增片段大小為731 bp，說明該菌株為羊種布氏菌，見圖2。

表1 布魯氏菌的種型鑒定結果Tab.1 Species and biovar identification for test strain

3 討 論

omp25蛋白是布氏菌的外膜結構蛋白，PCRPFLP分析顯示，不同種屬布魯氏菌的omp25基因具有高度的同源性，基因序列在布氏菌各種及生物型變種間高度保守。通過對6個種布氏菌標準菌株的omp25基因序列進行分析，僅有12個位點的核苷酸發生改變，同源性在98%以上，氨基酸序列差異不超過5個［5］，因此，omp25基因可用做鑒定布氏菌屬。

基于AMOS－PCR鑒定布氏菌屬、種具有快速、靈敏的優點，特異性和敏感性均高于細菌分離和血清學診斷方法，應用于國內菌株鑒定。它是Bricker等人在1994年根據布魯氏菌染色體中的遺傳成分IS711種特異性定位引起的多態現象建立，并根據在距IS711不同距離的引物雜交擴增產物大小來進行種型鑒定的PCR檢測方法，經過多年的發展，該方法現在已能精確辨認所有已知的布魯氏菌種［6－7］。

疫苗菌株具有很好的穩定性，而毒力較低。本次實驗選用羊種菌M5作為部分實驗對照，是一個降低了生物安全風險的嘗試，建議有關實驗室對相關疫苗株作為參照菌株進一步研究。

通過細菌學和分子生物學多種技術對湖北省首次分離菌株鑒定，證實為羊種3生物型布魯氏菌。流行病學個案調查顯示，患者系隨州市大堰坡鄉挑水村農民，家中養有山羊和綿羊，并從事屠宰工作，全村近年來并未出現羊群集體疫病現象，但有母羊流產現象，檢疫情況不詳。家中只有岳母與其一起居住，對其家人流調，沒有出現布病相關癥狀，但血清學檢測也呈陽性反應，效價1∶100。患者經治療痊愈，半年后隨訪未再發病。由此證實我省已有布病流行，并波及人間。建議在國家增加布病的監測點，規范對疑似布病發熱病人盡早采樣分離菌株。同時協調做好動物布氏菌分離，開展病原流行病學研究。

［1］徐楠，李娜.布氏桿菌病流行病學及診治研究進展［J］.中國實用醫藥，2010，5（20）：246－247.

［2］熊培生，晏慧芳，鄧朝暉，等.湖北省職業人群布魯氏菌病調查［J］.中國地方病學雜志，1993，12（4）：224－226.

［3］龔雪英，史天東.輸入性布魯氏菌病一例報告［J］.公共衛生與預防醫學，2007，18（3）：19.

［4］衛生部疾病預防控制局.布魯氏菌病防治手冊［M］.北京：人民衛生出版社，2008：17－29.

［5］胡劍飛，崔步云，關平原，等.布魯氏菌外膜蛋白的研究進展［J］.疾病監測，2010，25（5）：380－389.

［6］Mayer－Scholl A，Draeger A，G?llner C，et al.Advancement of a multiplex PCR for the differentiation of all currently described Brucella species［J］.J Microbiol Methods，2010，80（1）：112－114.

［7］姜海，崔步云，趙鴻雁，等.AMOS－PCR對布魯氏菌種型鑒定的應用［J］.中國人獸共患病學報，2009，25（2）：107－109.