尼古丁降解菌的分離鑒定和初步特性研究

江吉紅，商弘穎，吳立飛，陳連升，馬 云

（浙江工業大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310032）

尼古丁降解菌的分離鑒定和初步特性研究

江吉紅，商弘穎，吳立飛，陳連升，馬 云

（浙江工業大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310032）

從浙江省某農藥廠的活性污泥中分離得到一株尼古丁高效降解細菌，根據表型特征、生理生化特性和16S r DNA序列系統發育分析，將其鑒定為假單胞菌屬，命名為TW5.該菌株能以尼古丁為唯一碳源、氮源和能源生長，當接種量為5%時，菌株TW5在含500 mg／L尼古丁的基礎鹽液體培養基中降解尼古丁，12 h后降解率約為100%.該菌株降解尼古丁的最適pH為6.5～7.0，最適溫度為30℃.研究表明，該菌株具有很強的尼古丁降解能力，可用于處理含尼古丁廢棄物.

尼古??；降解；生物特性；假單胞菌

尼古丁（nicotine），俗稱煙堿，分子式為C10H14N2，是多種煙草中所特有的、最重要的生物堿，占煙草重量的1%～2%，是影響煙葉品質的重要因素之一，同時也是煙葉和卷煙的主要有害成分之一.

尼古丁是一種精神藥品，人類長期保持著吸食煙草的習慣.然而，尼古丁是煙葉和煙氣中主要致癌成分N-亞硝胺（TSNA）的重要前體物［1］，過量吸入會抑制人體中樞神經，麻痹心臟，嚴重者會有致命的危險［2］；尼古丁也是一種環境有毒物質，在常溫下，純凈的尼古丁是無色或淡黃色、味苦、有強烈刺激性的透明的油狀液體，在空氣中極易被氧化成暗灰色.煙氣環境中就含有大量的尼古丁，目前在我國的煙葉中尤其是在上部煙葉中尼古丁的含量普遍過高，這給煙葉的安全生產帶來很大的挑戰.同時，煙草在加工過程中會產生大量的高濃度尼古丁廢料，這種廢料被認為是“有毒的危險廢物”［3］，若直接排放到環境中，則對環境造成很大的危害.因此使得不斷控制和降低卷煙尼古丁含量成為國際煙草業發展的必然趨勢，同時也是降低吸煙危害的重要途徑之一，這對于維護人類健康有著深遠的意義.

較之物理、化學的方法去除烤煙中的尼古丁，微生物法具有操作簡單、易改造等獨特的優勢，越來越受到人們的關注.早在20世紀40年代，就已經有關于微生物降解尼古丁的報道.目前國內外的研究者已經分離得到多株尼古丁降解菌，主要有：假單胞菌屬［4－7］、節 桿 菌 屬［8］、纖 維 單 胞 菌 屬［9］、蒼 白 桿 菌屬［10］、芽孢桿菌屬［11］等.這些微生物多數能利用尼古丁為唯一碳源、氮源和能源進行生長，它們主要通過吡啶途徑［8－12］、吡咯途徑［13－14］、脫甲基化途徑［15－16］將尼古丁轉化為羧酸和氨基酸，為微生物的生長提供碳源、氮源和能源，從而達到降解有毒廢物的目的.

本研究中從杭州農藥廠分離篩選得到一株尼古丁高效降解菌，通過對其進行菌種鑒定和降解特性的研究，發現該菌株可能存在全新的降解途徑，這為更全方面的了解尼古丁的降解途徑提供了依據，也為構建具有更高降解效率和能耐受更高尼古丁濃度的工程菌建立了基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富集用的活性污泥采自杭州農藥廠.

基礎 鹽 培 養 基 （MM）：NH4NO31.0 g／L，K2HPO41.5 g／L，KH2PO40.5 g／L，MgSO40.2 g／L，NaCl 1.0 g／L，加入自行配置的微量元素溶液1 mL，pH 7.0.

基礎鹽固體培養基：基礎鹽培養基中加入1.5%～2%的瓊脂粉.

LB培養基：蛋白胨10.0 g／L，酵母膏5.0 g／L，NaCl 10.0 g／L.

固體LB培養基：LB培養基中加入1.5%～2%的瓊脂粉.

以上培養基與緩沖液均經過高壓蒸汽滅菌（121℃，25 min）.

尼古丁原藥購自伊普瑞斯（純度為99%），使用前將尼古丁原藥溶于無菌水中，按所需濃度添加到培養基中.

抗生素購自上海捷倍思公司；PCR引物由上海英駿生物技術有限公司合成.

1.2 試驗方法

1.2.1 尼古丁降解菌的分離與純化

取上述活性污泥5 g放于100 mL的基礎鹽培養基中，其中基礎鹽培養基中尼古丁的質量濃度為500 mg／L，30℃，150 r／min搖床培養7 d后，以5%接種量轉接至新的含尼古丁的基礎鹽培養基中，連續富集、轉接5次，尼古丁的濃度逐漸提高到1 000 mg／L.取富集后的培養液經梯度稀釋后（10－3，10－4，10－5，10－6）涂布于含1 000 mg／L的尼古丁基礎鹽固體培養基平板上，30℃培養.待平板上出現單菌落后，挑取單菌落劃線于LB固體培養基中，反復劃線進行純化，將純化后的菌落接種至LB固體斜面培養基中保存.

1.2.2 菌種的鑒定

16S r DNA序列和系統發育分析：采用細菌16S r DNA的通用引物（上海英駿生物技術有限公司合成），其正向引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG23′，反向引物序列為：5′-CGGCTACCTTGTTACGACTTC23′［17］進 行 16S r DNA 的 PCR擴增.PCR產物的純化和測序由上海英俊公司完成.測序結果利用Blast在GenBank基因庫中進行同源性比較和鑒定.將16S r DNA序列和與其同源性高的序列用DNASTARver.7.1.0中的 multiple sequence alignment software CLUSTAL W分析，并用Megalign構建系統發育樹.

1.2.3 尼古丁降解實驗

（1）檢測方法

尼古丁殘留量的檢測：本實驗采用反相高效液相色譜法檢測無機鹽培養液中尼古丁的殘留量.降解液經過離心后（10 000 r／min，10 min，4℃），于4℃保存備用.高效液相色譜（HPLC）檢測條件：流動相為V（CH3OH）∶V（H2O）＝10∶90，其中水中含有1 m M H2SO4，分析柱為Grace Alltima C18 Column（4.6 mm×250 mm，5μm），流速為0.6 mL／min，進樣量為20μL，柱溫為30℃.

生物量的檢測：2 mL培養液經過離心（10 000 r／min，10 min，4℃）獲得菌體，用2 mL的基礎鹽培養基洗滌3次，然后用2 mL相同的基礎鹽培養基重新懸浮，在600 nm處測定其OD值（紫外可見分光光度計JASCO V-550型）.

（2）培養條件對降解菌生長和降解能力的影響

尼古丁起始質量濃度的影響：將培養16 h的菌體（5 mL菌液離心所得）接種到100 mL不同尼古丁起始濃度（200，500，1 500，4 000 mg／L）的基礎鹽培養基中，搖床振蕩培養（150 r／min，30℃）.連續測定細胞的生長和尼古丁的降解情況.

培養溫度的影響：將培養16 h的菌體（5 mL菌液離心所得）接種到100 mL含尼古?。?00 mg／L）的基礎鹽培養基中，在150 r／min和不同溫度（23，30，37，45℃）下培養，連續測定尼古丁的降解情況.

起始pH的影響：將培養16 h的菌體（5 mL菌液離心所得）接種到100 mL含尼古?。?00 mg／L）的基礎鹽培養基中，在不同起始pH（5.5，6.0，6.5，7.0，8.0，9.0），150 r／min，30 ℃條件下培養12 h，測定尼古丁的降解情況.

2 結果與討論

2.1 菌種的鑒定

形態及生理生化特征：選擇在含尼古丁的基礎鹽固體培養基中長勢最好的一株作為研究對象，命名為TW5.菌株TW5在LB固體培養基上生長7 d后，菌落邊緣擴散，呈淡黃色，表面光滑，濕潤，不透明.能利用葡萄糖、淀粉、吐溫40為唯一碳源，不能利用β－環糊精、乙酸鈉.甲基紅試驗（M.R）、過氧化氫酶為陽性，V P、氧化酶為陰性.菌株對氨芐具有抗性，而對氯霉素、卡那霉素和鏈霉素均沒抗性.

16S r DNA序列分析：根據16S r DNA序列構建系統發育樹（圖1），序列同源性分析表明，確定菌株TW5為Pseudomonas sp.

圖1 菌株TW5的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree by strain TW5

2.2 不同條件下尼古丁降解實驗

用（OD）600值和尼古丁殘留量表示菌株TW5生長和降解尼古丁的情況.

尼古丁初始濃度對菌株TW5的生長和降解影響分別如圖2，3所示，從圖2中我們可以看出菌株TW5在尼古丁質量濃度為200～1 500 mg／L的濃度范圍內都能生長良好，并且延滯期較短，從圖3中我們可以看出菌株TW5在9 h內對質量濃度為200 mg／L和500 mg／L的尼古丁的降解率接近100%，對于質量濃度為1 500 mg／L的尼古丁，12 h內的降解效率能達70%以上，24 h能將其降解接近完全.實驗過程中，我們發現當尼古丁質量濃度為4 000 mg／L時，菌株TW5仍能生長，而且菌株TW5能以尼古丁為唯一碳源、氮源和能源生長，是尼古丁的高效降解菌，對處理高濃度的尼古丁廢水有非常好的效果，可用于尼古丁廢水的集中修復.

溫度對菌株TW5降解尼古丁的影響如圖4所示，結果顯示溫度對TW5降解尼古丁的影響較大，菌株TW5在30℃以前，隨著溫度的升高，降解效率增大，當超過37℃時，降解率快速下降；降解的最適溫度為30℃.

不同初始PH值對菌株降解尼古丁的影響如圖5所示，結果顯示尼古丁的降解在pH 9.0時最差；pH 6.5～7.0之間較好，降解率都達到95%以上；降解的最適pH為6.5～7.0.

圖5 不同初始pH值對TW5降解尼古丁的影響Fig.5 Effect of pH on nicotine degrade by strain TW5

通過上述圖表分析可知菌株TW5降解尼古丁的最佳條件為30℃，pH 6.5～7.0.經過12 h的培養，菌株對質量濃度為500 mg／L的尼古丁的降解效率接近100%，24 h內能將質量濃度為1 500 mg／L的尼古丁降解接近完全，最高耐受尼古丁的濃度為4 000 mg／L.目前國內外關于尼古丁的降解途徑主要集中在吡咯途徑、吡啶途徑和脫甲基途徑方面，而用菌株TW5在加有尼古丁的基礎鹽培養基中進行降解實驗時，我們發現培養液的顏色會由無色慢慢變為綠色，最后變為酒紅色，這顯然與我們已知的尼古丁降解途徑存在著差別，目前國內外學者研究的菌株在降解尼古丁的過程中具有這種顏色變化的非常少，對這種綠色的產物以及其代謝途徑的研究也是非常少，菌株TW5中有可能存在著新的尼古丁降解途徑，這有待于以后的深入研究.

3 結 論

從浙江省某農藥廠活性污泥中篩到一株能以尼古丁為唯一碳源、氮源和能源的生長的假單胞屬的菌株TW5，其降解尼古丁的最佳條件是30℃，pH為6.5～7.0，最高耐受尼古丁的濃度為4 000 mg／L.菌株TW5在降解尼古丁的過程中溶液顏色有綠色和酒紅色產生，推測菌株TW5在降解尼古丁的過程中產生了綠色的代謝產物，有可能存在全新的尼古丁降解途徑，這對研究尼古丁的降解途徑有著非常重要的意義.

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Isolation and characterization of a nicotine-degrading bacterium

JIANG Ji-hong，SHANG Hong－ying，WU Li-fei，CHEN Lian-sheng，MA Yun
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhengjiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

A strain of bacterium designated as Strain TW5，capable of degrading nicotine efficiently，was isolated from sludge in a Hangzhou pesticide factory，Zhejiang province.Strain TW5 was identified preliminarily as Pseudomonas sp.based on its physiological and biochemical characters and the result of the 16S r DNA homologue sequence analysis.This bacterium could degrade approximately 100%of 500 mg／L nicotine in 12 h.Results of its degradation characteristics showed that the optimal pH and temperature for nicotine degradation were 6.5～7.0 and 30℃，respectively.TW5 showed high ability to degrade nicotine and has a potential strain for direct application in contain nicotine waste treatment.

nicotine；degradation；biological characteristics；Pseudomonas

X172

A

1006-4303（2011）06-0614-05

2010-09-03

國家自然科學基金資助項目（21007058）；浙江省自然科學基金資助項目（Y5100253）

江吉紅（1985—），女，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事環境微生物研究，E-mail：jiang044189＠sina.com。通信作者：馬云副教授，E-mail：mayun＠zjut.edu.cn.

（

陳石平）