腦缺血后處理對缺血再灌注腦組織線粒體通透性轉換的影響

李富強， 白宏英， 婁季宇， 曾志磊

缺血性腦卒中是一種高致殘高死亡的腦血管疾病，及時應用藥物溶栓或血管內支架疏通阻塞血管是改善患者預后的關鍵。然而，伴隨血管再通產生的大量自由基或活性氧可以加重腦缺血損傷，即再灌注損傷。缺血再灌注損傷有效預防方法不多。盡管大量研究證實腦缺血預處理可以有效減輕缺血再灌注損傷［1］，但由于該干預措施必須在腦缺血發生前實施，而缺血性腦卒中發生的不可預料性限制了其臨床應用價值。2006年Zhao等研究發現腦缺血再灌注早期給于短暫的缺血/再灌注循環可以顯著減少腦梗死面積，并提出了腦缺血后處理這一概念［2］。線粒體通透性轉換(mitochondrial permeability transition，MPT)被認為是引起細胞凋亡或壞死的關鍵因素［3］。腦缺血后處理的作用機制未明，可能與減少組織自由基損傷、減輕炎性因子釋放、減輕腦水腫等［4］有關。腦缺血后處理能否影響線粒體通透性轉換，尚未見有研究報道。因此，本實驗擬觀察缺血腦組織MPT在腦缺血后處理過程中的變化，進而探討腦缺血后處理的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物模型制作 采用Longa大鼠MCAO模型方法，略作修改。應用10%水合氯醛(3ml/Kg)腹腔注射麻醉，分離左側頸外、頸總動脈及頸內動脈，結扎頸外動脈遠端;在頸外動脈殘端剪一小孔，將4-0號尼龍線前端加熱形成圓球形后從殘端小孔插入，沿頸內動脈至大腦前動脈以阻斷大腦中動脈的血流。阻閉30min后抽出尼龍線，恢復再灌注。應用激光多普勒血流儀的探頭(P407，瑞典Perimed)檢測腦血流。切開左側顱頂皮膚，并清理顱骨表面筋膜，將探頭放置在左側囟門后中線外2mm處。左側大腦中動脈腦血流下降低于70%視為造模不成功予以排除。術中體溫由肛溫探頭監測儀監測，用150瓦燈泡烘烤維持肛溫37℃。

1.2 動物分組 清潔級SD雄性大鼠(250g～300g)由鄭州大學實驗動物中心提供。將SD大鼠隨機分成4組:(1)假手術組(sham);(2)缺血再灌注組(I/R);(3)缺血后處理組(Postcond);(4)延遲缺血后處理組(Delaypost)(每組n=20)。假手術組采用同樣的操作步驟，僅暴露頸總動脈但不插入頸內動脈;缺血再灌注組:缺血30min后給予再灌注;缺血后處理組:缺血30min再灌注時，立即給予30s再灌注/30s缺血處理，反復3個循環;延遲缺血后處理組:缺血30min再灌注15min后，再給予30s再灌注/30s缺血，反復3個循環(見圖1)。

圖1 實驗動物分組示意圖

1.3 腦組織勻漿的制備 各組大鼠(n=6)于再灌注30min后斷頭處死，用冷生理鹽水沖洗血跡后，濾紙拭干，稱重，按組織比生理鹽水1∶9加人冰冷的生理鹽水，制成10%勻漿。所有操作均在4℃下進行。

1.4 腦線粒體的制備 各組大鼠(n=6)于再灌注30min后斷頭處死，立即取出大腦，去除腦干、嗅球及小腦，留取左側大腦半球。冷生理鹽水沖洗血跡后，將腦組織置于預冷的勻漿介質(0.25mol/L Sucrose，0.1mol/L Tris-HCl，pH7.4，0.01 mol/L EGTA)的緩沖液中。用預冷的眼科剪將腦組織剪成2mm×2mm×2mm的小塊后充分勻漿，制成10%的勻漿。采用差速離心法分離線粒體，應用低溫高速離心機4℃以650×g離心20min后棄沉淀;取上清液以 7700×g離心 20min，將沉淀應用(0.25mol/L Sucrose，0.1mol/L Tris-HCl，pH7.4)溶液懸浮即制成線粒體懸浮液;上述操作均在4℃下進行［5］。采用Bradford法進行線粒體蛋白濃度測定。

1.5 腦梗死面積測定 大鼠腦缺血30min再灌注24h后，斷頭，迅速取腦，每組各8只。鼠腦沿冠狀切面切片，每片厚約2mm，腦片迅速置于2%的TTC溶液中37℃蘊育約30min，正常組織呈玫瑰紅色，缺血梗死組織則為蒼白色，10%福爾馬林溶液固定后，用數碼相機拍照后輸入計算機，應用圖像分析軟件計算梗死面積百分比。梗死容積=(對側正常組織容積－同側正常組織的容積)/對側正常組織容積×100%。

1.6 腦組織丙二醛測定 硫代巴比妥酸(TBA)法檢測組織丙二醛，脂質過氧化產物丙二醛可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合形成紅色產物，在532nm波長處有最大吸收峰。具體方法按南京建成科技有限公司試劑盒說明書進行操作。

1.7 線粒體通透性轉換孔開放測定 線粒體通透性轉換孔開放引起線粒體腫脹，導致線粒體吸光度下降［6］。應用線粒體腫脹測定液(0.2 mol/L sucrose，10mmol/L Tris-Mops，pH7.4，5mmol/L succinate-Tris，1mmol/L Pi-Tris，10μmol/L EGTA-Tris，2μmol/L rotenone，1μg/ml oligomycin)將線粒體稀釋濃度為 0.5mg/ml蛋白溶液。反應條件控制在25℃、pH7.4。反應開始在反應體系內加入150μmol/LCa2+作為激發劑，應用 UV-2000紫外分光儀(尤尼柯，上海)在540nm處檢測線粒體吸光度的改變。

1.8 統計學方法 數據分析采用SPSS11.0統計軟件處理，所有數據均采用±s來表示，組間比較應用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 缺血后處理對腦梗死容積影響 缺血再灌注24h后，缺血后處理組與缺血再灌注組和延遲缺血后處理組相比腦梗死容積明顯減小(P＜0.05);延遲缺血后處理組與缺血再灌注組相比腦梗死容積變化無顯著性差異(P＞0.05)(見圖2)。

圖2 缺血后處理對腦梗死容積的影響

2.2 缺血后處理對腦組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)的影響 與缺血再灌注組和延遲缺血后處理組相比，缺血后處理組和假手術組腦組織丙二醛含量顯著降低(P＜0.05);延遲缺血后處理組與缺血再灌注組相比，差別無統計學意義(P＞0.05)(見圖3)。

圖3 缺血后處理對腦組織MDA的影響

2.3 缺血后處理對通透性轉換孔的影響 缺血后處理明顯抑制Ca2+所誘發的540nm波長處線粒體吸光度的改變(P＜0.05)，而延遲缺血后處理組與缺血再灌注組兩者差別無顯著性差異(P＞0.05)(見圖4);延遲缺血后處理組和缺血再灌注組線粒體吸光度改變值明顯增加，但兩者間差異無統計學意義。

圖4 缺血后處理對線粒體通透性轉換的影響

3 討論

Zhao等首先應用大鼠大腦中動脈遠端永久閉塞聯合雙側頸總動脈短暫閉塞腦缺血再灌注模型，發現再灌注時立即給予3個30s缺血/再灌注循環可以明顯減少腦梗死容積，減少半暗帶區TUNEL陽性細胞數，減輕缺血區腦組織的氧化損傷等。其研究結果還表明，缺血后處理的保護作用與缺血嚴重度呈負相關，缺血越嚴重缺血后處理的保護作用越弱;再灌注損傷是缺血時期的重要病理過程，缺血后處理可以明顯減輕缺血再灌注損傷［2］。本研究結果提示:腦缺血后處理有明顯的腦保護作用;腦缺血后處理的腦保護作用有時間依賴性，再灌注時立即缺血后處理保護作用明顯，延遲15min的缺血后處理未顯示明確的腦保護作用。在實驗中我們應用大鼠大腦中動脈缺血模型發現:再灌注期即刻給予3個30s的缺血/再灌注循環的缺血后處理能明顯減小腦梗死容積，但延遲缺血后處理未能減少腦梗死容積。而且缺血后處理能明顯減少腦組織中膜磷脂過氧化代謝產物MDA的含量，而延遲缺血后處理未顯示類似的效應。

線粒體通透性轉換是反映線粒體功能及完整性的重要指標。線粒體內膜上的通透性轉化孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)非特異性開放將導致膜電位的崩潰，線粒體內呼吸鏈的解偶聯，細胞色素C及其他促凋亡因子的釋放導致細胞凋亡［7］。我們研究發現，腦缺血后處理能抑制Ca2+誘導的mPTP開放，而延遲15min的缺血后處理組與缺血再灌注組mPTP開放增加，兩組相比差異無統計學意義(P＞0.05)，結果表明延遲缺血后處理不能減少mPTP的開放。缺血后處理調節mPTP開放機制尚不清楚。實驗研究表明，活性氧促發和 Ca2+超載是影響 mPTP開放關鍵因素［8］。Zhao等研究發現缺血期缺血腦組織血流量下降了約50%，但再灌注早期缺血腦組織有類似充血的反應，腦血流增加到180.1% ±46.0%，而應用缺血后處理可以減弱再灌注早期的類似充血的反應［2］。在缺血期，由于無氧酵解增加，腦組織中乳酸含量明顯升高，線粒體ATP酶活性降低，ATP合成減少。由于ATP合成減少，不能有效泵出Na+、Ca2+，最終引起Na+、Ca2+超載，溶酶體泄漏，導致細胞骨架與細胞膜磷脂的損害［9］。應用藥物溶栓或血管介入使阻塞血管再通，可以阻斷上述病理過程。但隨之出現缺血再灌注損傷。再灌注早期血液中的氧與缺血組織內單電子物質相互作用，產生大量的活性氧，誘導mPTP開放破壞線粒體膜，加速線粒體膜腫脹破壞，釋放細胞色素C及其他促凋亡因子，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族誘導細胞凋亡或壞死［7］。我們推測缺血后處理可能通過減少再灌注時期活性氧的生成，增加線粒體對Ca2+超載的抵抗能力而起作用。缺血后處理可能通過減弱再灌注早期的類似充血的反應，減少活性氧的生成，減輕了線粒體膜的損傷，維持線粒體內外離子平衡。我們研究發現缺血后處理可以降低MDA的生成間接驗證了缺血后處理減少活性氧物質生成。延遲缺血后處理可能因不能有效減弱再灌注早期的類似充血的反應，故不能減少活性氧的促發，而不能起到腦保護作用。Argaud等在New Zealand兔心肌缺血再灌注模型研究中發現，心肌缺血后處理可以增加線粒體對Ca2+超載的抵抗能力、延遲Ca2+誘導的mPTP開放而起到心肌保護作用［10］。此類保護機制是否存在于腦缺血再灌注損傷模型中，有待于進一步證實。

當然我們的研究也有一定的局限性:首先我們僅僅觀察了24h內的腦保護作用，是否有更長久的腦保護作用尚未知。其次，我們選擇30s缺血/再灌注循環源自Zhao等的研究報告，是否是最佳干預時間尚未知，需進一步研究證實。再次，我們選擇延遲15min實施延遲缺血后處理，是基于在一些研究模型中發現再灌注早期活性氧生成在4～7min達峰值。延遲多久不會對缺血后處理腦保護作用產生干擾，還需進一步研究。

腦缺血后處理作為一種新奇的、簡單的腦保護措施，給臨床治療提供了一種新的治療策略。腦缺血后處理可能應用在藥物溶栓或血管內介入血管再通的治療過程中。但其安全性、有效性需要大量基礎與臨床研究去證實。總之，我們研究發現腦缺血后處理可能通過抑制mPTP開放起到腦保護作用，其保護作用有時間依賴性。腦缺血后處理可能會成為治療缺血性腦卒中新的方法之一。

［1］ Teiger HJ，Hanggi DH.Ischemic preconditioning of the brain，mechanisms and applications［J］.Acta Neurochirurgica，2007，149(1):1－10.

［2］ Zhao H，Sapolsky RM，Steinberg GK.Interrupting reperfusion as a stroke therapy:ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2006，26(9):1114－1121.

［3］ Kim JS，He L，Lemasters JJ.Mitochondrial permeability transition:a common pathway to necrosis and apoptosis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，304(3):463 －470.

［4］ Zhao H.Ischemic postconditioning as a novel avenue to protect against brain injury after stroke［J］.JCereb Blood Flow Metab，2009，29(5):873－885.

［5］ 弓景波，錢令嘉.分光光度法檢測心肌線粒體滲透性轉換［J］.中國應用生理學雜志，2001，17(1):97－99.

［6］ 李敬遠，王俊科，曾子明.外周苯二氮受體激動劑Ro5-4864抑制大鼠心肌細胞線粒體通透性轉換［J］.生理學報，2007，59(1):13－18.

［7］ Green DR，Kroemer G.The pathophysiology of mitochondrial cell death［J］.Science，2004，305(5684):626 －629.

［8］ Kroemer G，Galluzzi L，Brenner C.Mitochondrial membrane permeabilization in cell death［J］，Physiologrev，2007，87(1):99 －163.

［9］ Cour M，Gomez L，Mewton M，et al.Postconditioning:From the Bench to Bedside［J］.J Cardiovasc Pharmacol Ther，2011，16(2):117－130.

［10］ Argaud L，Gateau-Roesch O，Raisky O，et al.Postconditioning inhibits mitochondrial permeability transition［J］.Circulation，2005，111(2):194－197.