高糖對小鼠足細(xì)胞黏附功能的影響及黃芪多糖的干預(yù)作用*

李佑生 黎 帥 王文健 劉 毅 何燕銘 陳偉華 應(yīng) 健

1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院（廣東深圳 518020）

2復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所（上海 200040）

3上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（上海 200437）

高糖對小鼠足細(xì)胞黏附功能的影響及黃芪多糖的干預(yù)作用*

李佑生1黎 帥1王文健2劉 毅2何燕銘3陳偉華2應(yīng) 健2

1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院（廣東深圳 518020）

2復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所（上海 200040）

3上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（上海 200437）

目的 觀察高糖對體外培養(yǎng)足細(xì)胞的黏附功能及黏附分子的影響，以及中藥組分黃芪多糖改善這種損傷的效果。方法采用永生化小鼠足細(xì)胞株，通過溫度選擇的培養(yǎng)方法誘導(dǎo)足細(xì)胞分化，分為正常糖對照組（NG）（5mmol/L）、甘露醇高滲對照組（MA）、高糖組（HG） （30μmol/L）、高糖+黃芪多糖組（APS）（0.2g/L），干預(yù)3、6、12、24h后收集細(xì)胞，分別用熒光定量法和物理離心法檢測足細(xì)胞黏附功能；干預(yù)6、12h后，應(yīng)用實時定量PCR法及Western印跡法分別檢測足細(xì)胞α3、β1整合素mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果作用6、12h后，HG組α3、β1整合素mRNA及蛋白表達(dá)水平較NG組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而給予黃芪多糖后，其下降不明顯。結(jié)論高糖可明顯抑制足細(xì)胞的黏附功能，黃芪多糖對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷有改善作用。

足細(xì)胞 黏附功能 α3、β1整合素 黃芪多糖

糖尿病腎病足細(xì)胞的損害主要表現(xiàn)為腎小球足細(xì)胞數(shù)量減少，足細(xì)胞從基底膜上脫落，殘留足細(xì)胞為覆蓋面積增大的基底膜而代償性肥大、足突增寬，進(jìn)而使腎小球濾過屏障通透性增加，導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生，并最終形成腎小球硬化、腎功能進(jìn)行性喪失[1]。足細(xì)胞從腎小球基底脫失的一個重要因素，是足細(xì)胞的黏附功能異常，足細(xì)胞不能在基膜上“錨定”。α3、β1整合素對這種“錨定”起著重要作用。本研究觀察黃芪多糖改善高糖（HG）刺激下足細(xì)胞與GBM之間的黏附功能及其對α3、β1整合素表達(dá)的影響，以探討其改善糖尿病腎病蛋白尿的機制。

1 材料與方法

1.1 試藥 永生的小鼠足細(xì)胞（系來源于成年H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠，該細(xì)胞含有一個溫度敏感的SV40-T抗原基因，可由γ-干擾素誘導(dǎo)的H-2Kb啟動子調(diào)控，在33℃并有γ-干擾素誘導(dǎo)條件下，足細(xì)胞將處于未分化狀態(tài)，以保持其永生性）由英國Luigi Gnudi教授惠贈。RPMI-1640培養(yǎng)液、FBS均購自美國Gibco公司；Mouse γ-INF，Ⅰ型膠原，多聚賴氨酸購自美國Sigma公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；α3整合素抗體購自美國Upstate公司；β1整合素抗體購自美國Chemicon公司；β-actin抗體及HRP標(biāo)記的二抗均購自美國Santa Cruz公司；細(xì)胞黏附熒光定量試劑盒購自美國Calbiochem公司。黃芪多糖（98%）：復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所。丹酚酸B（75%）：上海基中藥業(yè)。

1.2 儀器 細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱（德國HERAEUS公司），OLYMPUS熒光倒置相差顯微鏡，酶聯(lián)免疫儀（酶標(biāo)儀），0.22μm微濾器。

1.3 足細(xì)胞的培養(yǎng)[2]足細(xì)胞生長于含10%胎牛血清（Gibco）、100U/mL青鏈霉素的 RPMI1640培養(yǎng)液中（Gibco），在 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育。培養(yǎng)瓶預(yù)先經(jīng)0.1mg/mL collagen I 37℃處理1h。細(xì)胞培養(yǎng)在33℃CO2培養(yǎng)箱中處于增殖狀態(tài)，培養(yǎng)液中加入50U/mL γ-INF預(yù)先瓶ING以促進(jìn)其增殖，每傳兩代γ-INF減為20U/mL，最后以10U/mL維持。待細(xì)胞生長至20%～30%融合時，轉(zhuǎn)入37℃ 培養(yǎng)箱，無需加入γ-INF，細(xì)胞處于37℃狀態(tài)1周為正在分化的足細(xì)胞，10～20d為已分化足細(xì)胞。

1.4 分組[2]取分化成熟的足細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔接種細(xì)胞1×104個細(xì)胞，以10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，體積200μL，按分組分別加入不同濃度D-葡萄糖、甘露醇、丹酚酸或黃芪多糖。（1）正常糖（NG）對照組：D-葡萄糖 5mmol/L；（2）甘露醇高滲 （MA）對照組：甘露醇25 mmol/L＋D-葡萄糖5mmol/L；（3）HG 組：D-葡萄糖 30mmol/L；（4） 高糖+黃芪多糖（APS）組：D-葡萄糖30mmol/L和黃芪多糖（終質(zhì)量濃度分別為0.2g/L）；分別作用 3、6、12、24h。 其中 6h 與 12h 兩個時間點收細(xì)胞測α3、β1整合素mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)水平。每組細(xì)胞設(shè)4個復(fù)孔，每個實驗組重復(fù)3次，計算統(tǒng)計量。

1.5 足細(xì)胞黏附功能測定 （1）采用細(xì)胞黏附熒光定量試劑盒檢測足細(xì)胞與BMC之間的黏附功能[3]。鋪有BMC及小牛血清（BSA）和多聚賴氨酸分別作為陰性對照和陽性對照的96孔板，將足細(xì)胞予無FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮，密度為1×105～5×105個/mL，種植于96孔板中，每孔加入100μL上述細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中并按上述實驗分組進(jìn)行干預(yù)后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μL PBS，沖洗2次，然后每孔加入 100μL；熒光 Calcein-AM 工作液，在 37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h，將96孔板放至激發(fā)波長485nm、發(fā)射波長520nm的熒光讀板儀上檢測相對熒光強度（RFU）。（2）采用離心方法測定足細(xì)胞與BMC之間的黏附能力[4]。將鋪有BMC的96孔板上已分化的足細(xì)胞，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中并按上述實驗分組進(jìn)行干預(yù)后，用PBS洗并移去漂浮細(xì)胞，然后在顯微鏡下計算每孔細(xì)胞的數(shù)目，每個實驗組設(shè)立3個復(fù)孔，取平均值作為離心前的細(xì)胞數(shù)，后將96孔板置于離心機中，1500g（GH 6.8rotor）離心10 min，使足細(xì)胞從BMC上脫落，在相同條件下計算每孔細(xì)胞的數(shù)目，以離心后的細(xì)胞數(shù)與離心前的細(xì)胞數(shù)比例反映足細(xì)胞黏附能力。

1.6 α3、β1整合素mRNA的表達(dá)水平測定 （1）提取總RNA：根據(jù)Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA。（2）逆轉(zhuǎn)錄cDNA：每個樣本取4μg總RNA，采用隨機引物MMLV反轉(zhuǎn)錄酶在50μL體系內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用Applied Biosystems PCR儀按70℃，3min；37℃，60min；95℃，5min 反應(yīng)條件循環(huán) 1 次得到 cDNA。（3）實時定量：β1整合素引物序列為上游5′-GTTCCATGCGTAGCGACAA3′，下游 5′-TTCTCCCTGCTTTCCACTTTAG3′，擴增片段大小為 245bp；α3整合素引物序列上游 5′-CCCTCGCTTTGTAGGTTA 3′， 下游 5′-GTCCCTGTCAGCCTCCACT 3′， 擴增片段大小為 126bp；β-actin引物序列上游 5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′， 下 游 5′-GTACTCCTGCTTGCTGATCC3′，擴增片段大小為211bp。取1μL cDNA加入總體積為25μLPCR 反應(yīng)體系中（2.5nmol/μL dNTPs2.5μL，10×Sybergreen I PCR 緩沖液 2.5μL，25mmol/LMgCl2溶液 1.5μL，10μmol/L 的上、下游引物各1μL，Taq聚合酶1U）。采用澳大利亞Corbett Research公司生產(chǎn)的Rotor-Gene3000 PCR儀進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5min，然后 95℃變性 10s，59℃退火15s，72℃延伸20s，擴增40個循環(huán)，最后72℃延伸5min。實驗結(jié)果采用熒光定量分析軟件讀取，計算樣本mRNA/β-actin mRAN的比值，每個實驗組重復(fù)3次，計算統(tǒng)計量。

1.7 α3、β1整合素蛋白的表達(dá)水平檢測 各組處理結(jié)束后分別收集細(xì)胞，每孔加入裂解液 （50mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.0、0.15mmol/L氯化鈉、2mmol/L二胺四乙酸、1%乙基苯基聚乙二醇-40、0.1%十二烷基硫酸鈉SDS、100μmol/L苯甲基磺酰氟化物、1μg/mL 抑肽酶、1μL/mL-巰基乙醇）1mL，采用橡皮刮子刮下細(xì)胞，振搖冰浴30min，于4℃內(nèi)以15000r/min離心20 min，取上清液即為細(xì)胞總蛋白，用考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度；加上樣緩沖液，以12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，100V電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。采用5%脫脂牛奶室溫內(nèi)封閉60min，加一抗于4℃過夜，然后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育60min，洗膜，用ECL化學(xué)發(fā)光劑（美國Santa Cruz公司產(chǎn)品）在X光片上曝光，顯影、定影、沖洗涼干后掃描蛋白條帶的光密度，以β-actin為內(nèi)參，采用Bio-Rad2000凝膠成像系統(tǒng)，應(yīng)用QUANTITY ONE軟件進(jìn)行吸光度分析。每個實驗組重復(fù)3次，計算統(tǒng)計量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

圖1 HG對足細(xì)胞與BMC之間黏附能力的影響

圖2 對足細(xì)胞與BMC之間黏附能力的影響

2.1 HG對足細(xì)胞與BMC之間黏附能力的影響及黃芪多糖的干預(yù)效果 圖1、圖2。由圖1可見，運用熒光定量法檢測HG組黏附至BMC上的足細(xì)胞數(shù)（以RFU反映）較NG組下降，且具有一定時間依賴性，在3h時開始下降，24h時作用最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而給予黃芪多糖后，其足細(xì)胞數(shù)較高糖組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由圖2可見，運用物理離心法檢測HG組離心后的足細(xì)胞數(shù)/離心前足細(xì)胞數(shù)的比值較NG組減少，在作用3h時，HG組離心后的足細(xì)胞數(shù)和離心前足細(xì)胞數(shù)的比值較NG組下降40%，作用24h時較NG組下降60%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而給予黃芪多糖后，其比值較高糖組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 HG對足細(xì)胞α3、β1整合素基因表達(dá)水平的影響及黃芪多糖的干預(yù)效果 見圖3。在作用6h與12h后，HG組整合素mRNA表達(dá)量均較NG組明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。而給予黃芪多糖后，其下降不明顯（P＞0.05）。

圖3 對足細(xì)胞β1、α3整合素基因表達(dá)水平的影響

2.3 HG對足細(xì)胞α3、β1整合素蛋白表達(dá)水平的影響及黃芪多糖的干預(yù)效果 見圖4、圖5。由上圖可見，HG組 6h、12h后β1整合素、α3整合素蛋白表達(dá)水平均較NG組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），而給予黃芪多糖后，其下降不明顯 （P＞0.05）。

圖4 足細(xì)胞α3、β1整合素蛋白表達(dá)水平

圖5 對足細(xì)胞β1、α3整合素蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

現(xiàn)有研究表明，足細(xì)胞損害在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。進(jìn)入臨床腎病的糖尿病患者存在足細(xì)胞丟失、殘存足細(xì)胞體積增大、足突增寬、足細(xì)胞覆蓋的腎小球基底膜（GBM）面積增大、GBM增厚、腎小球硬化及系膜膨脹等改變[2-3]。足細(xì)胞的肥大、變性，又可促使其進(jìn)一步從GBM上脫落、丟失，致使硬化腎小球的GBM廣泛裸露[4-5]，從而促進(jìn)DN的發(fā)展。

足細(xì)胞從GBM上脫落丟失有多種因素，如高灌注、機械張力牽拉、高糖高脂等，導(dǎo)致足細(xì)胞與GBM之間黏附功能的改變，引起足細(xì)胞損傷而脫落[5]，也是糖尿病腎病早期進(jìn)展的重要機制之一[6]。我們通過采用熒光標(biāo)記的細(xì)胞黏附試劑盒及物理離心兩種方法測定了足細(xì)胞與BMC之間的黏附能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HG刺激下黏附在BMC上的足細(xì)胞數(shù)均較NG組顯著下降，且隨HG刺激時間的延長，其抑制作用逐漸加強，尤以作用24h時最為明顯。而對照的甘露醇對足細(xì)胞黏附功能并無明顯改變，表明高糖能顯著抑制體外培養(yǎng)的足細(xì)胞黏附功能。

黃芪是治療糖尿病腎病蛋白尿的常用中藥，循證醫(yī)學(xué)分析也表明，黃芪對糖尿病腎病蛋白尿有較好的改善作用。黃芪多糖作為黃芪的主要成分之一，有改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的作用[7]。本研究提示，黃芪多糖還可通過改善高糖所致足細(xì)胞黏附能力的下降，達(dá)到減少足細(xì)胞脫失的作用。

現(xiàn)有研究表明，足細(xì)胞從腎小球基底脫失的一個重要因素，是足細(xì)胞的黏附功能異常，足細(xì)胞不能在基膜上“錨定”。α3、β1整合素對這種“錨定”起著重要作用。α3、β1作為足細(xì)胞黏附于基底膜的主要受體分子之一[7]，是足細(xì)胞上唯一的β1類整合素，對足細(xì)胞與GBM的結(jié)合起著關(guān)鍵性作用。有研究表明[8]，特異β1整合素抗體或β1整合素阻斷劑均可誘導(dǎo)足突融合、足突與GBM分離及蛋白尿的發(fā)生；α3整合素基因敲除小鼠出生時即出現(xiàn)GBM發(fā)育不成熟、足突消失及大量蛋白尿。我們的研究也提示，高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞，其α3、β1整合素表達(dá)水平明顯降低，提示這可能是導(dǎo)致足細(xì)胞黏附能力下降的主要機制。而黃芪多糖共培養(yǎng)的足細(xì)胞，其α3、β1整合素表達(dá)水平較之有較明顯的改善。說明黃多糖可通過提高α3、β1整合素表達(dá)水平，改善高糖損傷足細(xì)胞的黏附能力，從而達(dá)到防治糖尿病腎病蛋白尿的作用。

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Effect of High Glucose on Adhesion Function of Mouse Podocyte and Protective Effect of Astragalus Polysaccharide

LI You-sheng1，LI Shuai1，WANG Wen-jian2，et al
1Shenzhen People's Hospital，Guangdong Province，Second Clinical Medical College of Jinan University（Shenzhen518020，Guangdong）
2Huashan Hospital of Fudan University，Combination of Chinese Traditional and Western Medicine of Fudan U-niversity（Shanghai200040）

Objective：To observed the effect of high glucose （HG） on adhesion function of mouse podocyte and the result of astragalus polysaccharide improving the damage.Methods：Immortalized mouse podocytes were induced differentiation by temperature selection culture.Cells were divided into the normal glucose，the mannitol control group，the HG group and the HG plus astragalus polysaccharide （APS） group.At 3h，6h，12h，24h，cells were detected by the adhesive function by fluorescence quantitative and physical centrifugal.At 6h and 12h of treatment，these expressions including α3，β1 integrin mRNA and protein were detected by real-time PCR and western blot.Results：After 6h and 12h of treatment，these expressions including α3，β1 integrin mRNA and protein of HG group were lower significantly than those of normal glucose group.After being used astragalus polysaccharide，the reduction was not obvious.Conclusion：HG can remarkably inhibit mouse podocyte adhesion.There is a improvement effect in the astragalus polysaccharide in the podocyte damage induced by the astragalus polysaccharide.

Podocyte；Adhesion；α3，β1 integrin；Astragalus polysaccharides

R285.5

A

1004-745X（2011）09-1430-03

廣東省自然基金資助項目（8151802001000010）；廣東省中醫(yī)藥局資助項目（2007244）

2011-04-24）