水紅花子對(duì)免疫肝纖維化大鼠肝功能及血清肝纖維化標(biāo)志物的影響*

杜宇瓊 趙 暉 張秋云 法振鵬 季巍巍 車念聰

首都醫(yī)科大學(xué)（北京 100069）

水紅花子對(duì)免疫肝纖維化大鼠肝功能及血清肝纖維化標(biāo)志物的影響*

杜宇瓊 趙 暉 張秋云 法振鵬 季巍巍 車念聰△

首都醫(yī)科大學(xué)（北京 100069）

目的 觀察水紅花子對(duì)免疫肝纖維化大鼠模型血清肝纖維化標(biāo)志物的影響。方法40只wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、秋水仙堿組、水紅花子組。除正常對(duì)照組外，其余各組均給予腹腔注射無(wú)菌豬血清，劑量為0.3mL/100g，每周2次，連續(xù)12周。模型對(duì)照組、正常對(duì)照組每日灌服蒸餾水1mL/100g；其余各組灌服相應(yīng)藥物。采用放射免疫的方法觀察肝纖維化大鼠血清肝纖維化指標(biāo)（HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ）的變化。結(jié)果與模型對(duì)照組比較，各治療組血清學(xué)標(biāo)志物均有不同程度改善，其中秋水仙堿組PCⅢ、HA、LN顯著降低；水紅花子組LN、PCⅢ、HA、Ⅳ-C顯著降低。結(jié)論水紅花子可有效降低肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)，其作用優(yōu)于秋水仙堿。

水紅花子 免疫肝纖維化 肝功能

水紅花子性味辛、咸，微寒，歸肝、脾、胃經(jīng)，具有散血消癓，消積止痛的功效，在臨床已廣泛應(yīng)用于急慢性肝病中的各期的治療。但作為治療慢性肝病傳統(tǒng)藥物之一[1]，目前水紅花子各方面的研究工作還很不完善，其藥用機(jī)理、藥效學(xué)方面的研究還處于初步探索階段[2]。其對(duì)肝纖維化作用機(jī)理的研究尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立豬血清誘導(dǎo)的免疫肝纖維化大鼠模型，通過(guò)對(duì)血清肝纖維化指標(biāo)的觀察，初步探討水紅花子對(duì)豬血清誘導(dǎo)的免疫肝纖維化大鼠的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 wistar大鼠40只，雌雄各半，清潔級(jí)，體質(zhì)量（210±20）g，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：維通利華SEXK（京）2006-009。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，恒溫恒濕，任意進(jìn)食進(jìn)水，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，并進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)約7d。

1.2 藥物與試劑 豬血清購(gòu)自北京元亨金馬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)為100410；水紅花子（北京同仁堂有限公司，生產(chǎn)批號(hào)091117，產(chǎn)地：遼寧本溪），水煎成 100%濃縮液，4℃保存，秋水仙堿（購(gòu)于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：100617，用蒸餾水配成1mg/100mL的溶液）。 血清透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）試劑盒由中生北控生物科技股份有限公司提供。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒由北京北化康泰臨床試劑公司提供。

1.3 主要儀器 37℃恒溫箱、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀、光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；SABA-18全自動(dòng)生化分析儀、DY8f-1型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)，美國(guó)BEKCMAN公司；J-25型低溫高速離心機(jī)，中國(guó)寧波新芒科器研究所；HTEMRO超低溫冰箱，美國(guó)BEKCMAN公司；DU-530型紫外分光光度計(jì)，日本三洋公司；自動(dòng)γ放射計(jì)數(shù)儀。

1.4 分組與造模 40只大鼠進(jìn)行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、秋水仙堿治療組、水紅花子治療組。采用腹腔注射無(wú)菌豬血清（0.3mL/100g）進(jìn)行造模；正常對(duì)照組注射等劑量生理鹽水；每周2次，連續(xù)12周。

1.5 給藥方法 秋水仙堿組每日灌服秋水仙堿1次；水紅花子組每日灌服水紅花子水煎濃縮液1次，用量為0.12mL/100g；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組每日灌服蒸餾水1mL/100g；均連續(xù)12周，飼養(yǎng)條件相同，其中給藥組于造模第2日開(kāi)始灌服藥物。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 將大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉后大鼠固定于鼠板上，依次剪開(kāi)胸骨兩側(cè)皮膚肌肉；同樣方法剪開(kāi)胸骨柄下端的皮膚肌肉，注意防止剪斷血管，剪開(kāi)后將胸肋骨向上掀起，使心臟充分暴露。使用連接注射器的針頭，從心尖部縱向刺入心室腔，吸取血液至盡，注入干凈的試管內(nèi)保存。全血分離血清，于4℃靜置 30min后，4℃ 2500r/min離心 20min，分離血清，-80℃保存待檢（檢測(cè)血清酶、肝纖指標(biāo)及細(xì)胞因子等）。

2 結(jié) 果

2.1 水紅花子對(duì)血清肝功能指標(biāo)的影響 見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組大鼠比較，模型對(duì)照組大鼠血清ALT、AST、ALP水平均顯著升高（P＜0.05或0.01）；秋水仙堿組與模型對(duì)照組大鼠比較，血清 ALT、AST、ALP 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；水紅花子組與模型對(duì)照組比較，血清 ALT、AST、ALP 水平均顯著升高（P＜0.01）。

表1 各組肝纖維化大鼠血清肝功能指標(biāo) （U/L，±s）

與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組 別 n ALT正常對(duì)照組 10 42.70±4.95**AST 109.40±37.22**模型對(duì)照組 10 66.80±16.71* 90.20±27.03**ALP 69.30±27.24**140.00±35.76**秋水仙堿組 10 69.70±8.30** 168.00±44.63** 89.10±22.55**水紅花子組 10 41.70±7.21** 107.80±17.00** 63.90±20.43**

2.2 水紅花子對(duì)血清肝纖維化指標(biāo)的影響 見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組大鼠相比，模型對(duì)照組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C明顯升高（P＜0.01）；秋水仙堿組HA、LN、PCⅢ較模型對(duì)照組顯著降低（P＜0.05 或 0.01）；水紅花子組 HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ較模型對(duì)照組顯著降低（P＜0.05或 0.01）。

3 討 論

在慢性肝炎中肝細(xì)胞的炎癥、壞死是肝炎后肝纖維化的非常重要的啟動(dòng)因素之一。肝細(xì)胞持續(xù)、慢性的損傷，導(dǎo)致多種細(xì)胞（肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）、多種細(xì)胞因子參與的肝纖維化的形成與發(fā)展，是肝纖維化的過(guò)程中的首要問(wèn)題。所以有效保護(hù)肝細(xì)胞功能、防止肝細(xì)胞的炎癥與壞死，是抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，也是治療肝纖維化的重要策略之一。ALT、AST、ALP水平是臨床常用的反映肝細(xì)胞功能的重要血清生化指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究即以豬血清誘導(dǎo)的免疫肝纖維化模型為研究對(duì)象，觀察到經(jīng)水紅花子治療后，實(shí)驗(yàn)大鼠血清ALT、AST、ALP的含量均有不同程度改善，證明在水紅花子對(duì)豬血清誘導(dǎo)的免疫肝纖維化大鼠的肝細(xì)胞功能均具有保護(hù)作用，可以抑制肝纖維化大鼠肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

表2 各組大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ含量比較 （±s）

表2 各組大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ含量比較 （±s）

組 別 n HA（μg/L）正常對(duì)照組 10 97.70±4.44*LN（ng/mL）121.31±8.67*模型對(duì)照組 10 118.87±19.24 138.60±16.90秋水仙堿組 10 95.42±13.15**103.64±24.24**水紅花子組 10 93.65±16.86**122.88±23.21*Ⅳ-C（μg/L）98.32±16.81*131.06±25.60 131.74±14.90 113.45±17.44**PCⅢ（μg/L）111.11±11.90*125.42±17.18 113.71±25.37*114.72±21.71*

血清中HA、LN、Ⅳ-C及PⅢP是膠原組織的降解產(chǎn)物，也是臨床研究最多的肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)，目前已成為診斷肝纖維化的重要血清學(xué)標(biāo)志物。能夠反映肝纖維化時(shí)肝細(xì)胞外基質(zhì)的變化。其中，HA是反應(yīng)最為敏感，其含量變化與肝的纖維化程度呈正相關(guān)。LN反應(yīng)肝竇毛細(xì)血管化和匯管區(qū)纖維化，在肝纖維化晚期其升高更為明顯。Ⅳ-C是反應(yīng)肝內(nèi)基底膜膠原變化的可靠指標(biāo)[4]。PⅢP為肝內(nèi)正常膠原Ⅲ型膠原的前體，其血清含量可以反應(yīng)Ⅲ型膠原的代謝情況，并可反映肝纖維化程式度[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水紅花子治療后實(shí)驗(yàn)大鼠的血清學(xué)標(biāo)志物與模型對(duì)照組比較均有不同程度改善。證明水紅花子具有抗肝纖維化作用，其作用機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

以上結(jié)果表明：水紅花子可明顯改善肝纖維化大鼠的肝功能；使肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)下降，提示該藥具有明顯的抗肝纖維化作用。這為臨床應(yīng)用水紅花子治療肝纖維化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of Fructus Polygoni Orientalis on the Liver Function and Serum Liver Fibrosis Markers of Immune Liver Fibrosis Rats

DU Yu-qiong，ZHAO Hui，ZHANG Qiu-yun，et al
Capital Medical University（Beijing100069）

Objective：To explore the effect of fructus polygoni orientalis on the serum liver fibrosis markers of immune liver fibrosis rats.Methods：40 wistar rats were divided randomly into the normal group，the model group，the colchicinum group and the fructus polygoni orientalis group.Excluding the control group，3 groups were injected 0.3mL/100g swine serum to set up liver fibrosis.The model group and the normal groups were given NS frombaseline lmL/100g.Another groups were given the same volume/weight medicine respectively.Indices of serum liver fibrosis were observed by the radioimmunoassay method.Results：Compared with the model group，serum indices in the treatment group and the control group were improved.In the colchicinum group，the PCⅢ，HA and LN were decreased obviously.In the fructus polygoni orientalis group，the LN，PCⅢ，HA and Ⅳ-C were reduced remarkably.Conclusion：Fructus polygoni orientalis can significantly reduced the elevate levels of serum markers of liver fibrosis.Its effect is superior to that of the colchicinum.

Fructus polygoni orientalis；Immune liver fibrosis；Liver function

R285.5

A

1004-745X（2011）09-1433-02

北京市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目（JJ2009-18）

△通信作者

2011-04-26）