二仙湯加味對去卵巢大鼠心肌NF-κBp50、IκBα 的影響

韓為華 喬黎焱 劉鏝利 張麗萍 張志紅 馬 靜△

1第四軍醫大學（陜西西安 710032）

2第四軍醫大學西京醫院（陜西西安 710032）

二仙湯加味對去卵巢大鼠心肌NF-κBp50、IκBα 的影響

韓為華1喬黎焱1劉鏝利1張麗萍1張志紅2馬 靜1△

1第四軍醫大學（陜西西安 710032）

2第四軍醫大學西京醫院（陜西西安 710032）

目的 探尋二仙湯加味對去卵巢大鼠心肌保護作用的機制。方法采用5月齡雌性大鼠建立去卵巢模型，隨機分為空白對照組、模型組、加味二仙湯高、中、低劑量組、替勃龍組，每組8只。二仙湯組分別用二仙湯30、15、7.5g/kg生藥劑量給藥，替勃龍組用0.25mg/kg給藥，其余兩組給予3mL生理鹽水灌胃，各組持續灌胃60d。采用免疫組化法分析心肌NF-κBp50、IκBα的表達。結果模型組與各治療組、空白組比較，NF-κBp50、IκBα的表達均顯著增高。二仙湯各劑量組與模型組比較，NF-κBp50、IκBα表達明顯降低。二仙湯組對心肌NF-κBp50、IκBα改善優于替勃龍組。結論去卵巢大鼠心肌中存在NF-κBp50、IκBα的激活，加味二仙湯對其有一定抑制作用，可能是二仙湯心肌保護作用機制之一。

加味二仙湯 去卵巢 心肌細胞 NF-κBp50 IκBα

△通信作者

研究證實，女性絕經前保持在一定水平的雌激素對心血管系統有一定的保護作用。隨著絕經后卵巢功能的衰退，體內雌激素水平下降，血脂代謝異常，血黏稠度增加，從而導致動脈硬化、冠心病的發病率顯著增加，因此，絕經后冠心病機制的研究得到了廣泛重視。隨著研究的深入，核轉錄因子NF-κBp50及其抑制蛋白IκBα在絕經后冠心病發病機制中的作用備受關注。本研究采用細胞免疫組化法評價加味二仙湯對去卵巢大鼠心肌NF-κBp50、IκBα表達的影響，探討該方對心肌的保護機制.

1 實驗材料

1.1 動物 5月齡雌性SD大鼠48只，清潔級，體質量（300±10）g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。

1.2 藥物 二仙湯加味組成：仙茅9g，淫羊藿9g，知母6g，黃柏6g，巴戟天 9g，當歸 9g，香附 6g，葛根 15g，遠志 6g。 中藥由西京醫院中藥房提供，常規煎煮，濃縮為所需濃度中藥混懸液，含生藥3.0g/mL。替勃龍片 （南京歐加農制藥有限公司），稀釋為0.025mg/mL混懸液。以上藥液4℃冰箱保存備用。

1.3 試劑及儀器 NF-κBp50單克隆抗體及試劑盒：美國SantaCruz公司，武漢博士德生物技術有限公司生產；超薄切片機：德國Rechert-Jung公司；TDR-9070A恒溫干燥箱：陜西天美科學儀器有限公司；Motic Med 6.0 CMIAS系列數碼醫學圖像分析系統，麥克奧迪公司（中國廈門）生產；DAB顯色試劑；倒置顯微鏡。

1.4 分組與造模 將48只大鼠隨機分為6組：空白對照組、模型組、二仙湯高、中、低劑量組，替勃龍組，每組8只。大鼠經2%戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉后，摘除卵巢，術后第5日開始，連續5d陰道涂片，每日1次，證明去勢徹底。

1.5 藥物干預 造模成功10d進行藥物干預，二仙湯高、中、低劑量組分別用二仙湯30、15、7.5g/kg劑量給藥，替勃龍組用0.25mg/kg給藥，其余組給予生理鹽水3mL灌胃，各組持續灌胃60d。

1.6 標本采集與檢測 灌胃結束第2日，將大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，迅速剪開胸腔取心尖部組織，置于4%多聚甲醛溶液固定12h。 ①石蠟切片脫蠟、水化。②3%過氧化氫孵育5min，以阻斷內源性過氧化物酶。③將切片放入盛有EDTA抗原修復液中，置微波爐中加熱至95℃以上并持續10min，室溫下自然冷卻，修復抗原。④滴加工作濃度1∶100的特異性抗體NF-κBp50/IκBα覆蓋組織切片，置于濕盒內4℃過夜。PBS沖洗2min×3。⑤滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，37℃，20min，PBS沖洗，2min×3。⑥應用DAB溶液顯色。⑦蒸餾水沖洗、蘇木素復染、脫水、封片。采用CM IAS系列多功能真彩色病理圖分析系統對免疫組織學圖像進行分析，陽性細胞肌漿呈棕黃色表達。放大200倍，每張標本隨機輸入5個視野，取平均值，結果以面密度表示。

2 結 果

模型組心肌NF-κBp50、IκBα陽性表達均明顯高于其他組（P＜0.05），說明去卵巢能激活 NF-κBp50、IκBα 反應鏈，增加細胞因子 NF-κBp50、IκBα 的分解，并且激活 NF-κBp50 進入細胞核啟動相關靶基因轉錄。同模型組比較，二仙湯各劑量組NF-κBp50表達均明顯減弱 （P＜0.05），其中高劑量組降低最為明顯，說明加味二仙湯各劑量均可抑制止NF-κBp50分解以及NF-kBp50激活，且療效優于替勃龍組（P＜0.05）。

表1 各組去卵巢大鼠心肌 NF-κBp50、IκBα 表達比較 （±s）

表1 各組去卵巢大鼠心肌 NF-κBp50、IκBα 表達比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與替勃龍組比較，△P＜0.05。

組 別 n NF-κBp50（×10-2）空白對照組 8 5.41±1.62*模型組 7 16.54±2.48替勃龍組 7 13.21±1.74*IκBα（×10-2）4.38±0.52*16.21±1.55 14.26±0.53*二仙湯高劑量組 8 9.43±0.61*△ 10.34±0.17*二仙湯中劑量組 6 10.43±2.28* 12.17±0.85*二仙湯低劑量組 8 12.03±0.47*13.46±0.61*

3 討 論

中醫認為，女性絕經后冠心病的發病機理是由于陽氣不足，鼓動無力，血行不暢、瘀阻心脈所致，屬于本虛標實之證。而且女性絕經后卵巢功能減退，雌激素水平下降的生理特性與女子七七，腎氣虛衰、陰陽失調的病變基礎存在一定關系。因此，治療應側重從腎論治，以補腎通脈為綱，以益氣活血為基本治法，調整陰陽、調和沖任氣血[1]。加味二仙湯正是針對這一病機設立的有效方劑，是運用補益腎精、益氣活血之大法治療絕經后冠心病臨床療效顯著。

絕經后，隨著雌激素水平的不斷下降，機體脂質代謝異常，血黏稠度增加，導致動脈粥樣硬化、冠心病的發病率明顯上升。大量證據證實冠心病與機體的炎癥過程存在一定相關性[2-3]。炎性反應的分子基礎與NF-κBp50因子的異常表達相關。NF-κBp50是一種重要的核轉錄因子，當NFκB被激活并進入細胞核，與多種細胞基因啟動子或增強子序列位點發生特異性結合而引起一系列因子表達的增加，如內皮素-1（ET-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、白介素-1B（IL-1B ）、白介素-6（IL-6）等[4]。通過炎癥介質瀑布樣級鏈效應，引起心肌缺血再灌注損傷明顯增加以及冠脈血管內皮細胞功能嚴重損害，可見在心肌損傷炎癥發生發展中NF-κBp50的介導扮演著重要的角色[5]。

總之，NFκBp50（IκBα）-IL-1B 重要的基因調控環節在絕經后冠心病的發生、發展中起著重要作用[6]。其不僅增強了局部炎癥反應，而且發揮了轉錄調控靶基因的作用，即細胞的許多信號傳導途徑必須涉及到NFKB改變才體現出相應的效應。因此，在這一通路中任何一個環節細胞因子表達的增加，都會在絕經后冠心病的發病中發生級聯反應，導致病變的加重；而阻斷這一途徑的任何一個環節，可以切斷這一通路上游刺激物與下游靶基因的病理性聯系，起到預防病變的發生或中止病變的發展的作用。

本研究證實，加味二仙湯能降低NF-κBp50核因子及其抑制蛋白 IκBα的表達，我們認為該藥正是通過阻斷 NFκBp50（IκBα）-IL-1B這一通路，中斷了上游刺激物與下游靶基因病理性的聯系，進而干預了相關基因的轉錄調控，阻止了對心血管的嚴重損害來發揮其心肌保護的治療作用。所以說，抑制NFκBp50（IκBα）因子的表達，可能是加味二仙湯心肌保護作用的重要機制之一。

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[4]艾艷秋，謝小娟，張衛鹽酸戊乙奎醚對心臟瓣膜置換術患者心肌細胞NF 2κB活性及血漿TNF 2α水平的影響[J].鄭州大學學報，2009，44（5）：996-997

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R285.5

A

1004-745X（2011）09-1440-02

2011-04-05）