紅法夫酵母高產蝦青素菌株的選育

張蕊 周博 李賢宇 （天津渤海職業技術學院 天津300402）

蝦青素的化學名稱為3,3'-二羥基-4,4'-二酮基-β,β'-胡蘿卜素，分子式為C40H52O4（見圖1），相對分子量為596.86，是一種天然非維生素A原的類胡蘿卜素，廣泛存在于蝦蟹、鮭魚和某些藻類及真菌中，常用作魚蝦等水產養殖動物的飼料添加劑。[1]動物實驗表明蝦青素有抑制腫瘤發生、增強免疫功能、延緩衰老等多方面的功能，在功能食品、飼料、化妝品和醫藥等方面有著廣闊的應用前景。[2-4]

圖1 蝦青素的結構式

紅法夫酵母可以發酵糖類產生蝦青素，最初于1970年在美國阿拉斯加的高山和日本北海道一帶山區落葉松的滲出液中分離得到。紅法夫酵母有生長速度快、容易實現細胞高密度培養以及提取色素后的酵母細胞可以作為飼料添加劑等優點，已越來越受到人們的重視。但紅法夫酵母的野生型胞內蝦青素含量比較低，一般為0.05%細胞干重，要進行連續化生產最終實現較高的經濟效益，必須對紅法夫酵母原始菌株進行改造，以達到增產的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

1.1.1 菌種 紅法夫酵母（Phaffia rhodozyma），中科院微生物所提供，編號As2.1557。

1.1.2 培養基 搖瓶發酵培養基比例：葡萄糖20，酵母粉3，蛋白胨5，pH值自然。

1.1.3 主要儀器 紫外誘變箱（自制），高速離心機（北京醫用離心機廠），回轉式恒溫調速搖瓶柜（上海欣蕊自動化設備有限公司），高效液相色譜儀（美國Laballiance公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫外誘變 ①菌體前培養[5]：取活化后斜面種子1環接至盛有30 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，20℃，160 r/min振蕩培養48 h。然后取培養液5 mL接至盛有50 mL搖瓶發酵培養基的500 mL三角瓶中，20℃，160 r/min振蕩培養24 h，使細胞處于對數期后期。②誘變處理：取5 mL菌液于Ф75 cm的培養皿中（帶磁棒），置于紫外誘變箱的磁力攪拌器上，開啟磁力攪拌器，打開皿蓋，分別照射 5 s、10 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s。移取不同照射時間的菌液1 mL，將其稀釋到合適的濃度（3個梯度），然后分別取0.1 mL在固體完全培養基平板上涂布，每個稀釋度作3個平行，在20℃恒溫培養箱中培養2～3 d。待菌落長出后計數。

1.2.2 篩選[6-7]按照1.2.1的方法對出發菌株進行誘變處理，取誘變后的菌液3 mL接入盛有30 mL液體完全培養基的250 mL三角瓶中，20℃，160 r/min培養過夜，取10 mL培養液離心，收集菌體，洗滌后配制成濃度適中的菌懸液；取0.1 mL涂布于二苯胺抗性篩選平板上，20℃恒溫培養箱中培養2～3 d，待菌落長出后，挑選顏色較紅、較大的菌落點接于固體完全培養基平板上，挑選較紅的、生長較快的菌株接到斜面上，并編號保存。

2 實驗結果

2.1 出發菌株的致死曲線（見圖2）

圖2 出發菌株紅法夫酵母AS2.1557的紫外誘變致死曲線

根據誘變結果繪制出紅法夫酵母AS2.1557的紫外誘變致死曲線，如圖2所示。一般認為紫外誘變的致死率在75%～85%之間時菌株的突變率較高，本實驗選擇80%左右的致死率，即誘變時間為30 s。

2.2 出發菌株二苯胺抗性檢驗

二苯胺是八氫番茄紅素脫氫酶的抑制劑，能抑制類胡蘿卜素的合成。把紅法夫酵母涂布在含二苯胺的平板上，菌落為土白色。但如果細胞發生突變，八氫番茄紅素脫氫酶活性不再受二苯胺等抑制劑的抑制，該菌落便是紅色的。實驗研究了不同二苯胺濃度下出發菌株的生長狀況，其結果見表1。

表1 不同二苯胺濃度下出發菌株生長狀況

由表1可以看出，二苯胺在較低濃度下對出發菌株的生長狀況影響不大；當二苯胺濃度增加至50～80 μmol/L時，菌體的生長受到一定的限制，菌落較小，生長緩慢，顏色為土白色；當二苯胺濃度增加至150 μmol/L時，菌體的生長受到很大的限制，菌落極小，生長極其緩慢，菌落顏色較難辨別；當二苯胺濃度達到200 μmol/L以上時，菌體的生長受到抑制。

二苯胺不僅抑制紅法夫酵母胞內類胡蘿卜素的合成，而且強烈抑制紅法夫酵母的生長。但誘變后需要篩選的是菌落相對較紅的菌株，綜合考慮，誘變后的二苯胺篩選培養基的濃度選為 80 μmol/L。

2.3 高產菌株的篩選

按照方法1.2.1對出發菌株進行誘變處理，誘變時間為30 s。誘變處理后，取誘變后的菌液3 mL接入盛有30 mL液體完全培養基的250 mL三角瓶中，20℃，160 rpm培養過夜，取10 mL培養液離心，收集菌體，洗滌后配制成濃度適中的菌懸液，取0.1 mL涂布于濃度為80 μmol/L的二苯胺抗性篩選平板上，20℃恒溫培養箱中培養2～3 d，待菌落長出后，挑選顏色較紅、較大的菌落點接于固體完全培養基平板上，培養2～3 d后，挑選較紅生長較快的菌株接到斜面上，并編號保存。最終得到突變株81株，進一步篩選，共得到25株菌株，統一編號為Puv-1～Puv-25。

2.4 誘變菌株發酵性能的測定

2.4.1 高產菌株發酵性能的測定 對上述篩選的25株菌株進行發酵性能測定，實驗結果如表2所示，從中可以看出，Puv-7、Puv-11、Puv-16及Puv-24這4株菌的增產幅度較大。

2.4.2 誘變菌株的遺傳穩定性檢驗 將得到的4株高產突變菌株進行遺傳穩定性檢驗，連續液體傳20代，期間測定其發酵性能，結果如表3所示。從中可以看出，4株高產突變菌株除Puv-11產量有所下降外，其他3株遺傳性能比較穩定。

表2 高產菌株發酵性能的測定

表3 高產菌株的遺傳穩定性檢驗

3 結果討論

依照出發菌株紅法夫酵母AS2.1557的紫外誘變致死曲線，選擇致死率在80%左右，即誘變時間為30 s，對出發菌株進行誘變。經過篩選，得到突變株81株，進一步篩選，共得到25株菌株。經過發酵性能測定和菌株穩定性檢驗，最終得到3株穩定的高產菌Puv-7、Puv-16、Puv-24，其產量相對原始菌株分別提高了34.7%、35.3%和46%。■

[1]朱宏娟，田科雄，李玲，等.酵母在飼料工業中的新應用[J].飼料工業，2005（12）：23-25.

[2]王菊芳，吳振強，梁世中.蝦青素的生理功能及其應用[J].食品與發酵工業，1999，26（2）：66-69.

[3]姬德衡，錢方，祖國仁.微生物工程在保健食品開發中的應用[J].江蘇食品與發酵，2002（2）：32-34.

[4]Whyte，J.N.C，Sherry，K.L.Pigmentation and composition of flesh of Atlantic salmon fed diets supplemented with the yeast Phaffia rhodozyma [J].North American Journal of Aquaculture，2001，63（1）：52-57.

[5]FANG，T.J.and Chiou T.Y.Batch cultivation and astaxanthin production by a mutant of the red yeast phaffia rhodozyma NCHU-FS501[J].Journal of industrial Microbiology，2003（16）：175-181.

[6]王普，裘娟萍，鄭裕國，等.高產蝦青素的紅法夫酵母菌種的選育[J].微生物學通報，2002，29（1）：15-19.

[7]裘娟萍，沈寅初.紅法夫酵母高產蝦青素突變株的選育方法[J].工業微生物，2000（4）:55-57.