一個產氫產乙酸菌互營共培養體的培養基優化

李建政，高晨晨，2，張立國，劉 崇，金 羽，張 巖

(1.哈爾濱工業大學市政環境工程學院城市水資源與水環境國家重點實驗室，150090哈爾濱，ljz6677@163.com;2.國家城市給水排水工程技術研究中心，300074天津)

傳統理論認為，產甲烷階段是厭氧消化的限制步驟[1].然而，有研究表明，產氫產乙酸菌群的產氫產乙酸代謝對厭氧消化過程的限制作用要大于產甲烷菌群的產甲烷代謝[2－3]，產氫產乙酸菌代謝活性的增強，有望使厭氧生物處理系統的效能得到顯著提高[4－5].向厭氧生物處理系統中投加產氫產乙酸菌或產氫產乙酸互營共培養體則是達到這一目的的有效手段之一.產氫產乙酸菌對生長條件有較嚴格的要求，其純培養物很難得到[6－7].比較而言，產氫產乙酸菌互營共培養體的篩選和培養則相對容易.然而，目前關于產氫產乙酸菌互營共培養體的研究報道還十分匱乏[8－11]，如何有效地篩選和培養產氫產乙酸菌互營共培養體是需要解決的首要問題.在前期研究中[12]，以處理高質量濃度有機廢水的厭氧折流板反應器(ABR)中的活性污泥為樣品，分離得到一種產氫產乙酸共培養體7－m－2a.本文從產氫產乙酸菌的生理生態習性入手，研究了7－m－2a在不同碳源、氮源及不同質量濃度泛酸、鈣、鐵、鎂離子條件下的生長代謝狀況，優化了培養基，為其擴大培養并從中分純產氫產乙酸菌株奠定基礎.

1 實驗

1.1 菌種及其來源

研究采用的產乙酸互營共培養體7－m－2a，是以丙酸為底物的選擇性培養基，從本實驗室運行的ABR厭氧活性污泥中分離得到，對丙酸具有較強的降解和轉化能力.該共培養體含有氧化丙酸的專性互營質子還原菌Desulfotomaculum sp.Iso－W2，其伴生菌是能利用甲酸鹽和H2/CO2的Uncultured bacterium 054E12－B－DI－P58 和Sedimentibacter sp.JN18－A14－H.

1.2 培養基

其中，微量元素液(1 L):MnSO4·7H2O 0.01 g，ZnSO4·0.2 g，AlK(SO4)20.01 g;維生素液(1 L):鈷氨素0.01 g，抗壞血酸 0.025 g，核黃素 0.025 g，檸檬酸0.02 g，吡多醛 0.05 g，葉酸 0.01 g，對氨基苯甲酸 0.01 g，肌酸 0.025 g，刃天青(0.2%)0.2 mL，半胱氨酸 1 g，pH 7.0.

丙酸質量濃度梯度培養基:基礎培養基中的丙酸鈉質量濃度為 2.5、5、10、15、20、25 g/L，其他成分不變.

酵母膏培養基:將基礎培養基中的胰蛋白胨和NH4Cl去除，其他成分不變.胰蛋白胨培養基:將基礎培養基中的酵母膏和NH4Cl去除，其他成分不變.胰蛋白胨－酵母膏培養基:將基礎培養基中的酵母膏和胰蛋白胨質量濃度都調節為0.5 g/L，同時去除NH4Cl，其他成分不變.氯化銨培養基:去除基礎培養基中的酵母膏和胰蛋白胨，其他成分不變.復合氮源培養基:將基礎培養基中的胰蛋白胨、酵母膏和 NH4Cl用量均調節為0.33 g/L，其他成分不變.

鐵離子培養基:向基礎培養基中投加一定量的FeC12配制而成.培養基中的Fe2+質量濃度，根據研究需要分別調節為 44、66、88、110和132 mg/L.無鈣培養基:將基礎培養基中的CaCl2去除，其他成分不變.鎂離子培養基:向基礎培養基中投加一定量的MgCl2配制而成，培養基中的Mg2+質量濃度，根據研究需要分別調節為13、25、38、50和63 mg/L.泛酸培養基:向基礎培養基中投加一定量的泛酸，根據研究需要，將其質量濃度分別調節為10、20、30、40 和 50 mg/L.

1.3 靜態實驗方法

取容積為25 mL的厭氧管，注入10 mL的液體培養基，充氮脫氧，封蓋，滅菌;在超凈工作臺(SW－CJ－1G，蘇州凈化設備有限公司)上，用無菌注射器取7－m－2a菌懸液(OD600nm為0.8左右)3 mL接種;置于恒溫培養箱(PYX－DHS，上海博訊實業有限公司醫療設備廠)中38℃培養30 d.每個培養條件均采用3只厭氧管進行平行試驗.

1.4 分析項目與方法

pH采用PHS－25型酸度計測定.發酵氣產量采用注射器釋放并劑量，液相末端產物和發酵氣成分采用氣相色譜儀檢測[4].菌懸液細胞密度采用UV2300型分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)，以未接種的培養液作為空白對照，于波長600 nm處測定吸光度(OD).反應混合液的OD值用于反映菌體的增殖情況.

1.5 數據處理方法

生長代謝指標乙酸產量、氫氣產量、丙酸降解速率以及OD600nm均取3個平行測試的平均值，其標準偏差采用excel軟件中的STDEV函數計算.

其中，乙酸產量、氫氣產量和OD600nm均為培養30 d后的檢測值減去初始時刻的檢測值，而丙酸降解速率則以丙酸累積消耗量除以培養時間30 d而獲得.

2 結果與討論

2.1 丙酸質量濃度對7－m－2a菌群生長代謝的影響

調節基礎培養基中的丙酸鈉質量濃度為2.5、5、10、15、20、25 g/L，分別對產氫產乙酸菌互營共培養體7－m－2a進行30 d的培養.結果(表1)顯示，培養基中丙酸的質量濃度對7－m－2a的生長代謝有比較明顯的影響.在丙酸鈉質量濃度小于10 g/L時，7－m－2a菌群的生長代謝水平隨著丙酸鈉質量濃度的升高而呈現上升趨勢，并在丙酸鈉質量濃度為10 g/L時達到最高，其丙酸降解率和OD值分別為786 mg/(L·d)和1.6，乙酸和氫氣產量分別為2 749 mg/L和249 mL/L.當丙酸鈉質量濃度增加到10 g/L以上的水平時，7－m－2a菌群的生長代謝則呈現下降趨勢.因此，對于菌群7－m－2a的培養，采用10 g/L的丙酸鈉質量濃度是比較適宜的.

表1 丙酸質量濃度對7－m－2a生長代謝的影響

2.2 氮源對7－m－2a菌群生長代謝的影響

氮是細菌生長代謝所必須的大量元素.對于特定的微生物，其對不同氮源的利用效率存在顯著差異.為尋求培養7－m－2a菌群的最佳氮源，在基礎培養基的基礎上，分別探討了氯化銨、酵母膏、胰蛋白胨、胰蛋白胨－酵母膏、胰蛋白胨－氯化銨、胰蛋白胨－酵母膏－氯化銨等單一氮源和復合氮源對7－m－2a菌群生長代謝的影響，結果如表2所示.研究表明，以胰蛋白胨、酵母膏和氯化銨調配成的混合氮源對7－m－2a菌群的生長代謝最為有利，經過30 d的培養，丙酸降解速率、菌群增殖量(OD600nm)、乙酸和氫氣產量分別達到 870 mg/(L·d)、1.21、3 802 mg/L 和245 mL/L.而以酵母膏為唯一氮源時，7－m－2a的生長代謝最不理想，培養結束時，其丙酸降解率、OD600nm、乙酸和氫氣產量分別為862 mg/(L·d)、0.83、3 504 mg/L 和 230 mL/L.

表2 氮源對7－m－2a菌群生長代謝的影響

2.3 Fe2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響

許多氧化還原酶中都有鐵離子，它們作為酶的輔因子起著電子傳遞的功能.采用向基礎培養基中加入不同質量濃度 FeCl2的方式，探討了Fe2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響.

結果(表3)表明，Fe2+對7－m－2a菌群的生長代謝具有顯著影響.培養基中Fe2+質量濃度在44～88 mg/L時，菌群7－m－2a的生長狀況和產氫產乙酸能力隨著Fe2+質量濃度的增加而呈現上升趨勢，并在Fe2+質量濃度為88 mg/L時表現出最佳的生長代謝能力，在此條件下經30 d的培養，其丙酸降解速率、OD600nm、乙酸和氫氣產量分別達1 019 mg/(L·d)、2.2、3 909 mg/L 和 266 mL/L.而當培養基中的Fe2+質量濃度繼續增加時，7－m－2a的生長代謝則表現出了下降趨勢，說明過量的Fe2+會對菌群的生長產生抑制作用.分析認為，Fe2+促進7－m－2a菌群生長代謝的主要原因可能在于其參與了鐵氧還原蛋白的合成，而鐵氧還原蛋白是微生物產氫代謝的重要輔酶.Fe2+可以形成Fe－S原子簇為產氫反應提供電子，并激活氫酶，Fe2+的缺少可導致細菌甲酸裂解酶合成不足，進而抑制了產氫產乙酸代謝[13].

表3 Fe2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響

2.4 Ca2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響

如表4所示，培養基中Ca2+的有無對7－m－2a菌群的增殖影響并不顯著，但在添加1 g/L CaCl2的培養基中，7－m－2a菌群的產氫產乙酸代謝能力明顯高于不含Ca2+的培養基.在含Ca2+培養基中經30 d的培養，其乙酸生成量和產氫量分別為3 391 mg/L和259 mL/L，丙酸的平均降解速率為889 mg/(L·d);而在無Ca2+的培養基中，其乙酸生成量和產氫量分別為3 110 mg/L和243 mL/L，丙酸的平均降解速率為858 mg/(L·d).顯微鏡觀察發現，CaCl2在液體培養基中大多以結晶顆粒的形式存在，絕大多數菌體則聚集在這些顆粒表面，以游離狀態存在的菌體數量很少.對于這一現象需要給予辯證分析:培養基中添加適量的Ca2+，對于產氫產乙酸菌互營共培養體的培養是有利的，而要從中分離和純化產氫產乙酸菌，Ca2+的添加則是一個不利因素.

表4 Ca2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響

2.5 Mg2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響

Mg2+是微生物生長的必要物質，是許多酶的激活劑，因而添加適量的Mg2+可能會對產氫產乙酸菌活性的提高具有重要作用[14].通過向基礎培養基中添加不同劑量的MgC12，考察了Mg2+質量濃度對7－m－2a菌群生長代謝的影響.

結果(表5)表明，較低的Mg2+質量濃度對7－m－2a菌群的生長和產氫產乙酸代謝具有刺激作用，而Mg2+質量濃度較高時則表現為一定程度的限制作用.在13～63 mg/L的質量濃度范圍內，7－m－2a菌群在 Mg2+質量濃度為38 mg/L時表現出了較高的生長和代謝活性，在培養30 d后，其丙酸降解速率、OD600nm、乙酸和氫氣產量分別為 908 mg/(L·d)、1.58、2 939 mg/L和 291 mL/L.

表5 Mg2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響

2.6 泛酸對7－m－2a菌群生長代謝的影響

泛酸在微生物體內主要以輔酶(CoA)的形式參與糖、脂類、蛋白質的代謝，CoA有轉移酰基的重要作用，泛酸缺乏時，過氧化物酶系的脂肪酸β－氧化就會受到抑制，從而進一步影響到產氫產乙酸菌的生長代謝.因而，在培養基中適量添加泛酸，將有助于提高產氫產乙酸菌的代謝活性.實驗結果(表6)表明，低劑量的泛酸對7－m－2a菌群的生長代謝具有刺激作用.在質量濃度為10～50 mg/L的范圍內，7－m－2a菌群在泛酸質量濃度為30 mg/L時所表現出的生長代謝活性最高，經過30 d的培養，其丙酸降解速率、OD、乙酸和氫氣產量分別為910 mg/(L·d)、1.99、3 779 mg/L和250 mL/L.而當泛酸質量濃度大于或小于30 mg/L時，7－m－2a菌群生長代謝水平均有不同程度的降低.

表6 泛酸對7－m－2a菌群生長代謝的影響

2.7 各項最優指標對7－m－2a菌群的綜合影響

根據2.1至2.6的實驗結果，對產氫產乙酸菌互營共培養體7－m－2a的基礎培養基進行優化，即將其中的丙酸鈉、Fe2+和Mg2+的質量濃度分別調整為10、88和38 mg/L，以胰蛋白胨、酵母膏和氯化銨為混合氮源(分別為0.33 g/L)，同時添加30 mg/L的泛酸，調節培養基pH為7.采用優化后的培養基，在38℃下培養30 d，7－m－2a菌群對丙酸的降解速率為998 mg/(L·d)，乙酸生成量達3 947 mg/L，產氫量為295 mL/L，反應混合液的OD600nm達2.96.與各單因子的實驗結果(表1～6)比較可見，在優化條件下，7－m－2a菌群對丙酸的降解速率、乙酸生成量、產氫量以及菌體增殖量(OD600nm)要優于丙酸質量濃度、氮源、Mg2+和泛酸等單因子條件下的培養結果.以Fe2+為單影響因素的培養實驗中(表3)，獲得了1 019 mg/(L·d)的丙酸降解速率，這一結果高于優化條件下的998 mg/(L·d)，但諸如乙酸生成量、氫氣生成量以及菌體增殖情況等均不如在優化條件下的培養效果好.總體而言，經優化后的培養基比較適宜7－m－2a菌群的生長代謝.

3 結論

1)對于產氫產乙酸菌互營共培養體7－m－2a的培養，培養基中適量添加 Fe2+、Mg2+、Ca2+和泛酸可有效提高菌群的代謝活性.優化后培養基成分為，酵母膏 0.33 g，胰蛋白胨 0.33 g，微量元素液 10 mL，維生素液10 mL(添加泛酸 30 mg/L)，1 000 mL，pH 7.0，培養溫度采用38℃.

2)在優化培養基中38℃培養30 d，產氫產乙酸菌互營共培養體7－m－2a對丙酸的降解速率可達 998mg/(L·d)，乙酸生成量為3 947 mg/L，產氫量為295 mL/L，反應混合液的OD600nm達 2.96.

[1]TABATABAEI M，RAHIM R A，ABDULLAH N.Importance of the methanogenic archaea populations in anaerobic wastewater treatments[J].Process Biochemistry，2010，45(8):1214 －1225.

[2]NIE Y Q，LIU H.Acetate production by a coupled syntrophic acetogenesis with homoacetogenesisprocess:effect of sludge inoculum concentration[J].Environmental Technology，2009，30(2):141－150.

[3]LANGE M，AHRING B K.A comprehensive study into themolecularmethodologyand molecularbiologyof methanogenic Archaea[J].FEMS Microbiolgy Reviews，2001，5(12):553 －571.

[4]ZHU G F，LI J Z，WU P，et al.The performance and phase separated characteristics of an anaerobic baffled reactor treating soybean protein processing wastewater[J].Bioresource Technology，2008，99:8027 －8033.

[5]鮑立新，李建政，昌盛，等.ABR處理大豆蛋白廢水的效能及微生物群落動態分[J].環境科學，2008，29(8):2206－2213.

[6]李艷娜，許科偉，陳堅，等.厭氧生鏡體系中產氫產乙酸細菌的FISH定量解析[J].微生物學報，2007，47(6):1038－1043.

[7]ELSHAHED M S，MCINERNEY M J.Benzoate fermentation by the anaerobic bacterium syntrophus aciditrophicus in the absence of hydrogen—using microorganisms[J].Applied and Environmental Microbiology，2001，67(12):5520－5525.

[8]LI J Z，ZHENG G C，HE J G，et al.Hydrogen—producing capability of anaerobic activated sludge in three types of fermentations in a continuous stirred－tank reactor[J].Biotechnology Advances，2009，27(1):573－577.

[9]趙宇華，錢澤澍.硬脂酸降解菌與嗜氫產甲烷桿菌共培養物的研究[J].浙江農業大學報，1991，17(1):75－79.

[10]SIEBER J R，SIMS D R，HAN C，et al.The genome of Syntrophomonas wolfei:new insights into syntrophic metabolism and biohydrogen production[J].Environmental Microbiology，2010，12(8):2289 －2301.

[11]SOUSA D Z，SMIDT H，ALVES M M，et al.Ecophysiology of syntrophic communities that degrade saturated and unsaturated long － chain fatty acids[J].Fems Microbiology Ecology，2009，68(3):257 －272.

[12]李建政，孫倩，劉楓，等.一株產氫產乙酸菌互營共培養體的篩選及其群落結構解析[J].科技導報，2009，27(16):78－82.

[13]閔航.厭氧微生物[M].浙江:浙江大學出版社，1992:104－106.

[14]林明，任南琪，王愛杰，等.幾種金屬離子對高效產氫細菌產氫能力的促進作用[J].哈爾濱工業大學學報，2003，35(2):147－150.