GnRH激動劑曲普瑞林對卵巢癌細胞OVCAR3生長的抑制作用及對GnRHⅠ受體、GnRHⅡ受體表達的影響

李 敏，張艷賞，張明明，閆 萍

已有研究表明卵巢癌組織中有促性腺激素釋放激素 (Gn-RH)Ⅰ、GnRHⅡ及其受體的表達［1］，顯示人卵巢癌細胞具有合成和分泌GnRH的功能。目前國內關于GnRH激動劑對卵巢癌細胞系作用的報道較少，本研究以GnRH受體陽性的人卵巢低分化漿液性乳頭狀癌細胞株OVCAR3為研究對象，使用Gn-RH激動劑曲普瑞林作用于OVCAR3細胞，觀察其在體外水平對卵巢癌細胞生長的抑制作用及對GnRHⅠ受體和GnRHⅡ受體的影響，初步探討曲普瑞林抗腫瘤作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人卵巢低分化漿液性乳頭狀癌細胞株OVCAR3由河北醫科大學第四醫院科研中心保存。

1.2 實驗儀器 相差顯微鏡 (LH50A型，日本OLYMPUS公司)，低溫超速離心機 (UNIVERSAL－30RF型，德國Hettich公司)，－80℃超速低溫冰箱 (MDF－382型，日本SANYO公司)，－152℃超低溫冰柜 (MDF－1152 ATN型，日本SANYO公司)，紫外分光光度計 (756型，上海光學儀器廠)，PCR儀 (GeneAmp 9600型，美國PE珀金－埃爾默公司)，高速低溫離心機 (RS－28型，德國Hettich公司)，UVP凝膠掃描系統 (GelDoc－It TS型，美國UVP公司)，雙恒定時電泳儀 (DYZ－22A型，北京市六一儀器廠)，橋式電泳儀 (DYY－Ⅲ型，北京市六一儀器廠)。

1.3 主要試劑 RPMI－1640干粉 (美國GIBCO公司)，胎牛血清 (美國 GIBCO公司)，胰蛋白酶 (美國 Sigma公司)。MTT粉 (Sigma公司)，DMSO試劑 (成都化學試劑廠)，曲普瑞林 (輝凌制藥生產，由河北醫科大學第二醫院生殖中心提供)RT－PCR使用的試劑:Trizol Reagent(為Invitrogen公司產品)，氯仿，異丙醇，焦磷酸二乙酯DEPC(天根生化科技有限責任公司)，反轉錄酶 (AMV－RT，美國Promega公司)，核糖核酸酶抑制劑 (RNase Inhibitor，美國 Promega公司)，dNTP mix(美國 Promega公司)，PCR mix(美國 Promega公司)，隨機引物 (Random primers，美國Promega公司)，瓊脂糖 (agarose，美國Promega公司)，Oligo dT 15(北京天根生化科技有限責任公司提供)，DNA Marker－D(北京賽百盛基因技術有限責任公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養 復蘇:從－152℃超速低溫冰箱里取出所用腫瘤細胞的凍存管，放入37℃水浴箱中迅速解凍，1 000 r/min，離心5 min，棄去上清，加入新鮮培養基洗兩遍，移至培養瓶中，放置培養箱中培養，次日換液。腫瘤細胞用含10%胎牛血清的1640培養基，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規培養，1～2 d換液1次。消化傳代:貼壁細胞鋪滿90%以上時需要傳代，加入消化液適量，倒置顯微鏡下觀察，看見細胞收縮變圓，細胞間隙變大時棄去消化液，加入適量的培養基，吸管吹打成單細胞懸液，1 000 r/min，離心5 min;棄上清，加培養液，分至2～3個培養瓶，放置于37℃、5%CO2條件下，1～2 d換液1次。細胞計數:用95%乙醇洗凈計數板，擦干，取干凈蓋玻片覆于計數板上，將細胞懸液于一側滴加到蓋玻片中，在顯微鏡下用10倍物鏡觀察計數四角大方格中的細胞數，計算計數盤周邊四大格的細胞數，壓線者僅計數左側及上方。有2個以上細胞構成的細胞團按單個細胞計算，細胞團占10%以上時說明分散不充分，應重新制備細胞懸液后再進行計算。帶入下式得出每毫升原液中的細胞數:細胞數/ml=(4大格細胞總數/4) ×104×稀釋倍數，根據細胞總數決定如何稀釋成所需要的細胞濃度。

1.4.2 MTT法測細胞抑制率

1.4.2.1 實驗分組 卵巢漿液性囊腺癌細胞系OVCAR3表達2種GnRH受體［2］，故采用OVCAR3細胞來檢測促性腺激素釋放激素類似物 (GnRH－a)對細胞生長的影響。將6種濃度的 GnRH－a，即 10－2mol/L，10－3mol/l，10－4mol/L，10－5mol/L，10－6mol/L及10－7mol/L的GnRH－a作用于細胞影響其生長，時間分別為24 h，設5個復孔，找出最適濃度;對細胞生長抑制率最高的濃度作用24 h、48 h、72 h，比較最適作用時間。

1.4.2.2 操作步驟 收集對數期的人卵巢癌細胞用胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的1640調整細胞懸液濃度，每孔加入180 μl，約計細胞1×103個，96孔板周邊各孔不加細胞僅用培養液填充。本實驗共設置6個GnRH－a濃度處理組，濃度范圍10－7mol/L～10－2mol/L。5%CO2、37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底 (96孔平底板)，加入濃度梯度的藥物，濃度分別為 10－1mol/L、10－2mol/L、10－3mol/L、10－4mol/L、10－5mol/L 和10－6mol/L，每孔20 μl，設5 個復孔。生存對照孔則加0.9%氯化鈉溶液20 μl。5%CO2、37℃孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20 μl MTT溶液 (5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續培養4 h。每孔加入150 μlDMSD，置脫色搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值 (OD)。每次樣本測定均在30 min內完成，實驗重復3次。根據以上做出的劑量－效應關系，選擇一個最佳GnRH－a劑量進行時間－效應關系的觀察，在用藥后24 h、48 h、72 h進行MTT檢測，具體方法同上。細胞抑制率=1－(OD實驗組/OD對照組) ×100%。

1.5 GnRHⅠ受體和GnRHⅡ受體的測定

1.5.1 RT－PCR檢測GnRHⅠ受體、GnRHⅡ受體的表達

1.5.1.1 主要試劑的配制 GnRH－a藥物的配制:將藥物用0.9%的氯化鈉溶液溶解，配制成為10－3mol/L、10－4mol/L和10－5mol/L。

1.5.1.2 目的基因的合成 GAPDH上游引物:5'－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3'，下游引物:5'－TCCACCACCCTGTTGCTG－3'。GnRHⅠ受體上游引物:5'－GAAAAGCAACAGCAAAGTCGG－3'，下游引物:5'－AGGGAGTCCAGCAGACAGTA－3'。GnRHⅡ受體上游引物:5'－GGACTTAGTTTCCTGCTTGCC－3'，下游引物:5'－GATGGCTGGGTCAAATGGTATT－3'，引物序列依據文獻報道設計，由上海生物工程公司合成。

1.5.1.3 實驗分組 將細胞分為對照組和實驗組，第1組為對照組，不加藥物;第2、3、4、5、6、7組為實驗組，為加藥物的細胞，濃度為 10－6mol/L、10－5mol/L和 10－4mol/L，分別培養24 h(2、3、4組)和48 h(5、6、7組);收集細胞檢測GnRHⅠ受體、GnRHⅡ受體的表達，并進行比較。

1.5.2 RT－PCR的實驗步驟

1.5.2.1 細胞培養 收集對數期的細胞，調整細胞懸液濃度，使用6孔板，每孔加入5×105個細胞，加新的培養基270 μl。在倒置顯微鏡下觀察，待細胞完全貼壁后加藥，每孔30 μl，濃度為10－4mol/L、10－5mol/L和10－6mol/L，有一對照孔不加藥。置于5%CO2、37℃孵育24 h、48 h。每個樣品重復5組。

1.5.2.2 提取RNA 收集細胞，倒去培養基，用PBS液沖洗3遍，每孔細胞加1 ml的Trizol，用槍頭反復吹打使細胞完全裂解，加入200 μl氯仿，劇烈振蕩混勻30 s，在臺式離心機上，12 000 r/min，4℃離心20 min。將上清液小心轉移到Rnase－free的1.5 ml離心管里，加入等體積的異丙醇，－20℃下放置過夜。臺式離心機上12 000 r/min，4℃離心20 min，棄去上清液，用70%乙醇洗滌2次，每次900 μl，12 000 r/min，4℃離心5 min。干燥3～5 min，沉淀用20 μl DEPCH2O溶解。

1.5.2.3 提取RNA的完整性檢測 將RNA提取液4 μl與上樣緩沖液2 μl混合，1%瓊脂糖凝膠 (含EB)，電泳緩沖液1×TBE，120 V電泳5 min，凝膠成像系統觀察。

1.5.2.4 提取RNA的定量 用756型紫外分光光度計測量OD260/OD280比值，可檢測RNA的純度和含量，選用OD260/OD280比值為1.8～2.0的RNA用作反轉錄。

1.5.2.5 cDNA第一鏈合成 第一步:加入RNA原液3 μl，Oligo dT 15 1 μl，Nucleasr－Free Water 6 μl，共10 μl反應液，70℃水浴10 min后，迅速置于冰上。第二步:加入5×R.T.buffer×5 μl，dNTP 1 μl(原液 10 M)，RNasin 1 μl(原液20 U)，M－MLV 1 μl(原液 5 U)Nucleasr－Free Water 7 μl，共15 μl反應液。42℃反應3 h后－20℃凍存備用。

1.5.2.6 PCR 配置PCR反應液完成后放入PCR儀，擴增條件94℃ 1 min，55℃45 s，72℃ 45s(5個循環)，在進行94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min(25個循環)，72℃ 延伸10 min。

1.5.2.7 RT－PCR產物半定量 取RT－PCR產物8 μl，加上樣緩沖液2 μl，在1%瓊脂糖凝膠 (含EB)上電泳，120 V，10 min，用UVP凝膠圖像成像系統拍攝并打印實驗結果，用凝膠圖像分析系統 (Gel－Pro Analyzer Version 3.0)分析結果。

1.6 統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理，計量資料采用 (±s)表示，所得結果行方差齊性檢驗、單因素方差分析，兩兩比較采用SNK－q檢驗，以α=0.05為檢驗水準，當P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 曲普瑞林對卵巢癌細胞OVCAR3生長的影響 MTT測定結果，10－7mol/L濃度的曲普瑞林作用細胞24 h后，其細胞抑制率為 (41.07±0.43)%，隨著濃度梯度的不斷增高，10－6mol/L、10－5mol/L、10－4mol/L、10－3mol/L、10－2mol/L 細胞抑制率分別為 (50.56±0.76)%、(69.86±1.05)%、(65.43±0.87)%、(62.09±1.24)%、(58.69±0.87)%;10－5mol/L濃度的曲普瑞林抑制率最高，差異有統計學意義 (P＜0.05);以10－5mol/L濃度的曲普瑞林作用于細胞24 h、48 h、72 h后，細胞抑制率分別是 (69.86±1.08)%、 (58.69±0.98)%、(48.56±1.02)%，最終是作用時間在24 h時細胞的抑制率最高，差異有統計學意義 (P＜0.05，見圖1)。

2.2 GnRHⅠ受體和GnRHⅡ受體的表達 RT－PCR測定曲普瑞林作用于細胞后，GnRHⅠ受體的表達:10－6mol/L、10－5mol/L、10－4mol/L曲普瑞林作用于 OVCAR3 24 h時，10－5mol/L GnRHⅠ受體表達高。10－5mol/L曲普瑞林作用于OVCAR3 24 h時較48 h時GnRHⅠ受體表達增高 (見圖2)。GnRHⅡ 受體的表達:10－6mol/L 、10－5mol/L、10－4mol/L曲普瑞林作用于 OVCAR3 24 h時，在10－5mol/L GnRHⅡ受體表達高，10－5mol/L曲普瑞林作用于OVCAR3 24 h時較48 h時GnRHⅡ受體表達量高 (見圖3)。

圖1 不同濃度曲普瑞林作用24 h GnRHⅠ受體電泳圖Figure1 Electropherogram of PCR product of GnRHⅠR and GAPDH;Compared with expressions of GnRHⅠR between different groups

圖2 10－5mol/L相同濃度曲普瑞林作用不同時間GnRHⅠ受體表達Figure2 Electropherogram of PCR product of GnRHⅠR and GAPDH;Compared with expressions of GnRHⅠR between different groups

圖3 10－5mol/L濃度曲普瑞林作用不同時間GnRHⅡ受體表達Figure3 Electropherogram of PCR product of GnRHⅡR and GAPDH;Compared with expressions of GnRHⅡR between different groups

3 討論

GnRH存在多種亞型，主要調節性腺內受體形成和激素功能。已從脊椎動物和原索動物的神經組織中分離出24種不同的GnRH，它們組成了一個神經肽家族，研究顯示只有GnRHⅠ (哺乳動物GnRH)與GnRHⅡ (雞GnRH)基因出現在人類基因組。其相應受體GnRHⅠ受體和GnRHⅡ受體的基因也在人類基因組中被發現［3－4］。GnRH高表達于激素依賴性腫瘤，并對其生長發揮重要的調控作用?，F有研究表明GnRH及其受體不僅對生殖系統良性腫瘤有調節作用，而且對生殖系統惡性腫瘤也有同樣的作用。有證據表明GnRH－α對某些激素敏感的腫瘤具有直接抑制其癌細胞分裂增殖的作用［5］。GnRH－a能降低促性腺激素水平，因此，可以通過此種途徑起間接抗腫瘤作用。

常用的GnRH激動劑是人工合成的九肽類似物。如國產的LRH－A3和國外的Buserelin、Triptorelin等。Triptorelin即曲普瑞林。有資料表明曲普瑞林對多種腫瘤有一定的治療作用。Borroni等［6］所研究的GnRH拮抗劑醋酸亮丙瑞林抑制體外異位內膜細胞的增殖，發現藥物在10－9～10－5mol/L濃度時，有明顯的抗細胞增殖作用，而且在10－5mol/L濃度時，出現最大的抑制效應。我們推測同樣作為性激素依賴性疾病的卵巢腫瘤應用GnRH類似物治療會有一定意義。

國外研究表明，在卵巢癌及卵巢癌細胞株中有兩種形式GnRH及GnRHmRNA的存在［7－8］。因而認為卵巢癌局部有Gn-RH自分泌系統的存在。GnRH－α對腫瘤的直接作用也可能存在于卵巢癌。近年來研究GnRH－α用于性激素依賴性疾病的治療表明，GnRH－α對表達GnRH受體的人前列腺癌細胞系生長有明顯抑制作用［9］。Emons等［10］進行了Ⅱ期臨床試驗探討應用GnRH激動劑AESZ－108靶向治療LHRH受體陽性的腫瘤的耐受劑量。Chianese等［11］研究顯示AEA一種GnRH拮抗劑也對林蛙GnRHⅠ、GnRHⅡ表達產生影響。

本實驗將不同濃度的曲普瑞林 (10－2～10－7mol/L)作用于卵巢癌細胞培養24 h，在低濃度10－7mol/L時即對細胞有抑制作用，且隨濃度的增高，在曲普瑞林為10－5mol/L時，抑制率最高，成時間－劑量依賴效應。這與Borroni等［6］的實驗結果相一致，推測在運用曲普瑞林治療卵巢癌的作用機制中，至少有部分是以旁分泌或自分泌形式作用于靶組織。研究結果顯示，GnRH激動劑對人OVCAR3細胞有顯著的抑制作用。

GnRHⅠ受體的表達:RT－PCR測定不同濃度triptorelin作用于OVCAR3 48 h時，在10－5mol/L GnRHⅠ受體表達高。當曲普瑞林濃度為10－5mol/L，作用24 h時細胞GnRHⅡ受體表達最高。GnRHⅡ受體的表達結果與GnRHⅠ受體相似。顯示GnRHⅠ受體和GnRHⅡ受體的表達變化與抑制腫瘤細胞生長作用有關。但目前有關GnRH及其類似物抑制卵巢癌細胞增殖的機制尚不十分明確，國內外研究仍無定論，還需要進一步研究。

從本研究結果可以進一步推測，在體外實驗中，GnRH激動劑曲普瑞林抑制GnRH受體陽性的人卵巢癌OVCAR3細胞增殖的作用機制，是通過首先激活GnRHⅠ受體和GnRHⅡ受體的表達完成的，以上結果仍有待于體內實驗進一步證實。可以設想應用GnRH－α及其他細胞毒性藥物制成聯合制劑，通過GnRH受體的介導在抑制腫瘤細胞增殖的同時殺死癌細胞，所以GnRH－α有可能成為治療人類卵巢癌的一種切實可行的新型抗腫瘤的生物制劑。這些研究將有助于為抗腫瘤新藥的研發提供依據。

1 李敏，吳小華，徐翠清，等.GnRHⅠ，GnRHⅡ及其受體在人卵巢惡性上皮性腫瘤細胞中的表達及意義［J］.第四軍醫大學學報，2008，29(24):2281－2283.

2 Grundlker C，Gunthert AR，Millar RP，et al.Expression of gonadotropin releasing hormoneⅡ (GnRHⅡ)receptor in human endometrial and ovarian cancer cells and effects of GnRH II on tumor cell proliferation［J］.J Clin Endacrinol Metab，2002，87(3):1427－1430.

3 Tanriverdi F，Gonzalez－Martinez D，Sileriza LF，et al.Expression of gonadotropin－releasing hormone type－I(GnRH－I)and type－II(GnRH－II)in human peripheral blood mononuclear cells(PMBCs)and regulation of B－lymphoblastoid cell proliferation by GnRH－I and GnRH－II［J］.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2004，112(10):587－594.

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5 Imai A，Horibe S，Takagi H，et al.Singal transduction of GnRH receptor in the reproductive tract tumor［J］.Endocrinlogy，1996，43:249－260.

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11 Chianese R，Ciaramella V，Fasano S.Anandamide modulates the expression of GnRH－II and GnRHRs in frog，Rana esculenta，diencephalon［J］.Gen Comp Endocrinol，2011，23:epub ahead of print.