苦丁茶提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶的影響

周衛華 米長忠 吳仕筠 鐘 飛 (吉首大學醫學院，湖南 吉首 416000)

苦丁茶是我國南部和西南部民間一種常用植物，民間使用歷史悠，其主要分布在桂、粵、黔、瓊等地，苦丁茶作為一種植物藥茶在我國西部和南部地區廣泛的各民族中被廣泛飲用?，F代藥理學研究表明其具有清熱解毒、殺菌消炎、健胃消積、止咳化痰、生津止渴、提神醒腦、明目益智和抗輻射、活血脈和調節血脂等功效〔1，2〕。本實驗以D-半乳糖致衰老小鼠為模型，觀察苦丁茶提取物對D-半乳糖致衰老小鼠的學習記憶力的影響，以便為苦丁茶應用和開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 昆明種2月齡清潔級小鼠40只，雌雄各半，體重(20±2)g，由吉首大學動物中心提供?？喽〔栀徸约资胁枞~店，產地為廣西大新縣溢江林場。樣品已經水蒸氣“殺青”、晾干，并經鑒定確認為冬青科苦丁茶。D-半乳糖，購自Sigma公司，用生理鹽水配成0.8%的濃度。SOD試劑盒(批號:091006)、MDA試劑盒(批號:091126)均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備 UV-3100紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)。TGL-16G低溫高速離心機(上海醫用分析儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 苦丁茶提取物液的制備 苦丁茶提取液為我室自行制備，流程如下:苦丁茶葉粗粉200 g(粗粉)，15倍量水浸泡20 min，煎煮2 h，共提取2次，合并兩次液，濃縮至200 ml，使每毫升含原生藥1 g，臨用前按比例配制成高劑量為1 g/ml，低劑量為0.5 g/ml。

1.3.2 衰老動物模型的制備與實驗分組 實驗動物隨機分為4組(正常組、模型組、苦丁茶提取物高、低劑量組)，每組 10只。模型組、苦丁茶提取物兩個劑量組，頸背部皮下注射0.8%D-半乳糖 0.5 ml/20 g(200 mg/kg)，1 次/d，持續 6 w〔3，4〕，空白組注射同劑量的生理鹽水。從第1天開始，苦丁茶提取物兩個劑量組每日灌胃10 g/kg(以生藥記)、20 g/kg的苦丁茶提取物進行實驗干預，模型組和空白組也灌胃等量的生理鹽水。

1.3.3 Morris水迷宮實驗 采用改良的Morris水迷宮實驗，參考聶榮慶等〔5〕的方法，水迷宮為圓形水槽，直徑60 cm，高17 cm，水深11 cm，測試過程中室溫保持在18℃ ～22℃。在槽壁上等距離地標記4個點分別為NESW，這4個點作為實驗起始點。在NW象限中間固定位置處放一透明玻璃平臺，高9.5 cm，直徑6 cm，使其低于水面1.5 cm。在水面覆蓋一層大小相似，直徑約為1.5 mm的泡沫顆粒屑，使平臺不可見。水槽周圍有豐富的固定不變的參照物(包括試驗者本身)，以供小鼠定位。參考Williams等〔6〕的方法，訓練共歷時5 d，分為每天上下午兩個時段，每個時段訓練四次。訓練開始將平臺放在NW象限的固定位置處，將小鼠從槽壁四個起始點分別放入水槽中，記錄從放入小鼠到小鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)，四次訓練分別從不同的起點放入小鼠，小鼠找到平臺后，讓小鼠在平臺上休息30 s，再進行下一次訓練。如小鼠120 s仍找不到平臺，則由實驗者將小鼠放置于平臺上，逃避潛伏期記為120 s，也讓小鼠在平臺上休息30 s。

1.3.4 小鼠腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量測定 實驗結束后同一部位的腦組織150 mg，吸干水漬后置入液氮保存。測定前稱質量，剪取適量腦組織塊，研磨成10%組織勻漿，3 000 r/min離心30 min，取上清液，按試劑盒說明書進行操作，測定上清液中SOD、MDA含量。

2 結果

2.1 苦丁茶提取物對小鼠Morris水迷宮成績的影響 小鼠用D-gal皮下注射連續6 w后模型組逃避潛伏期延長〔(31.9±8.35)s〕，與正常組相比〔(22.4±5.73)s〕有顯著性差異(P ＜0.01)，灌胃給予20、10 g/kg苦丁茶提取物后，逃避潛伏期縮短〔(23.9±7.82)，(25.1±7.2)s〕，與模型組相比有顯著性差異(P＜0.05)，但未能達到正常組水平。

2.2 苦丁茶提取物對小鼠腦組織SOD活性、MDA含量的影響模型組小鼠腦組織SOD活性降低，MDA含量升高，與正常組有顯著性差異(P＜0.01)，苦丁茶提取物灌胃給藥后小鼠腦組織中SOD活性升高，MDA含量降低，與模型組有顯著性差異(P＜0.05)，同樣未能達到正常組的水平。見表1。

表1 苦丁茶提取物小鼠腦組織SOD活性和MDA含量的影響(± s，n=10)

表1 苦丁茶提取物小鼠腦組織SOD活性和MDA含量的影響(± s，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 劑量(g/kg)SOD活性(U/mg prot)MDA含量(nmol/mg prot)正常組 － 208.8±36.12) 16.68±1.362)模型組 － 151.1±35.3 19.68±1.76苦丁茶提取物低劑量組 10 177.3±30.71) 18.27±1.081)苦丁茶提取物高劑量組 20 190.2±33.41) 18.01±1.411)

3 討論

多種動物給予D-半乳糖導致衰老，許多研究證明，該模型動物多種細胞的病理變化也符合自然衰老時出現的癥狀，并用作抗衰老藥物的研究〔7〕。實驗結果表明，給予D-半乳糖后，小鼠學習與記憶能力明顯下降，模型組與對照組相比，水迷宮實驗成績均明顯處于劣勢，這說明衰老模型復制是成功的。灌胃給予苦丁茶后，小鼠水迷宮實驗均明顯優于模型組，苦丁茶能夠改善由D-半乳糖誘導衰老小鼠的學習和記憶能力。

D-半乳糖可在體內氧化產生自由基，當超過機體的清除能力時，可引起脂質過氧化作用的鏈式反應，導致細胞膜損傷〔8〕。自由基可作用于細胞膜，攻擊膜磷脂質中的不飽和脂肪酸形成脂質過氧化物，使膜的結構功能遭到破壞，通透性增加，進一步增強細胞的損傷。SOD是清除自由基最有效酶之一，其活性增高間接證明組織清除自由基能力增強;MDA是自由基傷不飽和脂肪酸生成的脂類過氧化分解產物，降低可間接證明組織中自由基水平降低。有研究表明MDA可引起精神行為改變，并通過交聯、結合形成質褐脂質，引起神經系統功能障礙〔9〕。陳薇研究表明，苦丁茶葉中含有多酚和黃酮在體外有較強的抗氧化功能〔10〕。楊彪研究表明，苦丁茶對大鼠離體肝組織的具有一定抗氧化作用，對脂質過氧化有一定的抑制作用〔11〕。D-gal衰老模型小鼠灌胃給予苦丁茶提取SOD活力升高，MDA含量減少，表明苦丁茶提取物可減輕脂質過氧化反應、降低脂質過氧化物的含量、提高機體抗氧化能力和清除自由基能力，這也可能是苦丁茶提取物提高D-gal衰老模型小鼠學習記憶能力、改善衰老的作用機制之一。

1 黃燮才.常用中草藥識別與運用〔M〕.第2版.北京:化學工業出版社，2003:364-6.

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3 龔國清，徐黻本.小鼠衰老模型研究〔J〕.中國藥科大學學報，1991;22(2):101-3.

4 朱亞珍，朱虹光.D-半乳糖致衰老動物模型的建立及其檢測方法〔J〕.復旦學報:醫學版，2007;34(4):617-9.

5 聶榮慶，張 進，胡國柱，等.腦細胞活性因子對消化素學習、記憶能力的影響〔J〕.中國行為醫學科學，2002;11(5):488-9.

6 Williams MT，Morford LL，Wood SL，et al.Developmental D-methamphetamine treatment selectively induces spatial navigation impairments in reference memory in the Morris water maze while sparing working memory〔J〕.Synapse，2003;48(3):138-48.

7 楊紅英，李經才.褪黑素對D-半乳糖衰老模型小鼠的作用〔J〕.中國藥理學通報，2000;16(4):397-40.

8 崔 旭，李文彬，張炳烈，等.自由基損傷與D-半乳糖所致細胞老化關系〔J〕.基礎醫學與臨床，2000;20(1):24-6.

9 馬 虹，徐 鐮，蘇 平，等.不同水溫游泳對小鼠行為、記憶和脂質過氧化影響差異的研究〔J〕.中國應用生理學雜志，1999;15(3):233-4.

10 陳 薇，王恒山，黃世穩，等.大葉苦丁茶抗氧化成分及抗氧化性能研究〔J〕.廣西植物，2002;22(5):463-6.

11 楊 彪，龍盛京，覃振江，等.苦丁茶提取物抗氧化作用的研究〔J〕.廣西民族學院學報(自然科學版)，2000;6(2):108-10.