ICAM-5對Aβ神經毒性的保護作用

涂秋云 丁斌蓉 楊 霞 唐湘祁 (中南大學湘雅三醫院神經內科，湖南 長沙 4003)

近幾年研究發現，腦卒中和腦缺血后阿爾茨海默病(AD)的發生率顯著增加，缺氧是AD的病因之一〔1〕。但缺氧介導AD的病理過程的具體分子機制還不十分清楚。研究證實缺氧通過改變α、β和γ分泌酶的作用，修飾淀粉樣前體蛋白(APP)的加工過程，導致Aβ的生成顯著增加〔2〕，并且缺氧還可通過不同途徑增加APPβ位點裂解酶1(BACE1)的基因和蛋白表達，導致Aβ的生成顯著增加〔3〕。對于缺氧是否會增強Aβ的神經毒性，或缺氧可導致神經元細胞抵抗Aβ神經毒性的能力降低，目前還沒有研究報道。細胞間黏附分子5(ICAM-5)在神經元的結構和功能發展中有重要作用，可促進神經元樹突生長和突出可塑性改變〔4〕。在低氧的環境中，AD的發生率顯著增加，這些是否與神經細胞在低氧環境下，細胞內的ICAM-5出現變化，從而使細胞的自我保護機制受損，Aβ對神經元的毒性作用增強，導致AD的發生率增加呢?在缺氧環境中，ICAM-5是否對Aβ神經毒性誘導的神經細胞凋亡有保護作用呢?目前國內外在這一方面尚未見研究報道。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人神經母細胞瘤細胞株(芬蘭赫爾辛基大學生命科學院 Carl G.Gahmberg教授贈送的PAJU細胞);Aβ42(rPeptide公司);MTT(Sigma公司);DMEM powders(Gibco公司);胰蛋白酶粉(Amoresco公司);倒置相差光學顯微鏡(Nikon ELLIPSE TS100);低溫高速冷凍離心機(Eppendorf)。

1.2 方法

1.2.1 Aβ42的“老化”處理 以儲存濃度為231 μmol/L置于37℃的PBS中孵育7 d左右即為“老化”狀態。

1.2.2 細胞培養 人神經母細胞瘤細胞系PAJU-ICAM-5細胞及PAJU-NEO細胞分別以5×105/孔接種于6孔細胞培養板，37℃，培養穩定后，分組:①常態組:常態PAJU-NEO細胞及PAJU-ICAM-5細胞組，50 ml/L CO2培養箱培養96 h;②Aβ干預組:將培養穩定的PAJU-ICAM-5細胞及PAJU-NEO細胞予以濃度為1.0 nmol/L老化的Aβ42干預，繼續培養96 h;③缺氧組:將常態PAJU-NEO細胞及PAJU-ICAM-5細胞置于缺氧環境(1% ～2%O2、5%CO2、93%N2培養箱)培養 96 h;④Aβ 干預+缺氧組:將常態PAJU-NEO細胞及PAJU-ICAM-5細胞予以濃度為1.0 nmol/L老化的Aβ42干預，并置于1% ～2%O2、5%CO2、93%N2培養箱培養96 h。收取細胞樣品，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態的變化、MTT法觀察細胞凋亡的情況。

1.2.3 MTT法觀察細胞 檢測細胞增殖取對數生長期的上述各組細胞，于干預前1 d以5×104/孔接種于無菌的96孔板中，繼續培養24 h，然后再根據各組細胞的實驗要求進一步按上述方法處理和培養至96 h，棄去培養基，加入5 g/L MTT 20 μl后繼續培養 4 h，最后加入 150 μl DMSO，酶標儀測定各孔A490 nm吸光度值。計算公式:細胞存活率=(試驗組A490值－空白對照組A490值)/(陰性對照組A490值－空白對照組A490值)×100%。

1.3 統計學處理 采用SPSS10.0統計軟件進行統計分析，各時間點中各組吸光度值均以±s表示，用析因分析對各時間內各組吸光度值進行統計分析。

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察結果 ①PAJU-NEO細胞分別經Aβ42處理、缺氧處理后，細胞數量減少，突起變短、減少;缺氧并Aβ干預組的細胞數量明顯減少，突起變短、減少、甚至消失。② PAJU-ICAM-5細胞分別經Aβ42處理、缺氧處理后，神經突起分支數目無明顯變化，僅突起變短、增粗，缺氧并Aβ干預組的細胞數量減少，突起變短。③PAJU-ICAM-5細胞的突起長度明顯較PAJU-NEO細胞的突起長(P＜0.05)，PAJU-ICAM-5細胞雖經Aβ毒性作用，但無明顯變短和損壞，細胞體相對較完整。見圖1。

圖1 各組細胞形態學變化(×400)

2.2 MTT比色法顯示缺氧條件下Aβ42對PAJU細胞凋亡的影響 對照組PAJU-NEO細胞24、48和96 h后，存活率依次為(0.98 ±0.11，0.94 ±0.15，0.92±0.23，n=3);經 Aβ42處理24、48和96 h后，PAJU-NEO細胞存活率依次為(0.78±0.13，0.57±0.21，0.37±0.14，n=3);經缺氧處理24、48和96 h后，存活率依次為(0.82±0.17，0.67±0.24，0.63±0.14，n=3);同時經Aβ42和缺氧處理24、48和96 h后，存活率依次為(0.65±0.11，0.51±0.11，0.31±0.10，n=3)，經兩兩組間比較其差異具有統計學意義(P＜0.05)，另外，對照組與缺氧并Aβ42處理組間比較具有極顯著差異，并具有統計學意義(P＜0.01)。說明缺氧、Aβ42對細胞存活具有一定的抑制作用，缺氧可以加重Aβ42對細胞存活的抑制作用，其抑制效應呈時間依賴性。

PAJU-ICAM-5組細胞，在經缺氧處理組、Aβ42處理組、缺氧并Aβ42處理組 24、48及 96 h后，細胞存活率依次分別為(0.99±0.11，0.97 ± 0.15，0.95 ± 0.23，n=3;0.89 ± 0.12，0.76 ±0.21，0.68 ±0.11，n=3;0.84 ±0.12，0.66 ±0.25，0.47 ±0.13，n=3;0.75 ± 0.13，0.68 ±0.11，0.52 ±0.19，n=3)，組間兩兩比較，對照組與低氧組、Aβ組比較，其凋亡率顯著增加，差異具有統計學意義(P＜0.05);對照組與缺氧并Aβ42處理組比較，其凋亡率極顯著增加，差異具有統計學意義(P＜0.01);缺氧組與Aβ組比較，其凋亡率無顯著變化，差異無統計學意義(P＞0.05)。

PAJU-NEO細胞系與PAJU-ICAM-5細胞系分別予以相同的處理(缺氧、Aβ42、缺氧并Aβ42處理)后進行組間凋亡率比較有顯著差異(P＜0.05)。

3 討論

研究表明Aβ神經毒性涉及介導氧化應激及炎癥反應、神經元內鈣超載、誘導細胞凋亡、改變突觸功能等多個方面〔5～10〕。我們研究發現Aβ干預PAJU-NEO細胞及PAJU-ICAM-5細胞后，細胞的形態發生了一系列變化:PAJU-NEO細胞系細胞數量減少，突起變短、減少;PAJU-ICAM-5細胞系細胞數量減少，突起變短，但突起數量無明顯變化。同時，MTT法顯示Aβ干預組的細胞存活率較常態組降低，且細胞的存活率隨時間的延長而降低，說明Aβ可以降低細胞活性、誘導凋亡，進而說明Aβ的神經毒性之一是誘導細胞凋亡，且其抑制效應呈時間依賴性。

本研究發現，缺氧作為一個獨立因素干預PAJU細胞后，PAJU-NEO細胞系細胞數量減少，突起變短、減少;PAJU-ICAM-5細胞系細胞數量減少，突起變短，神經突起無明顯變化。同時，MTT法顯示缺氧組的細胞存活率較常態組降低，且細胞的存活率隨時間的延長而降低，說明缺氧作為獨立因素可以降低細胞活性、誘導其凋亡，且其抑制效應呈時間依賴性。所以缺氧也可以導致神經毒性，與目前的觀點缺氧是AD的重要危險因素之一相符合，但缺氧介導AD的病理過程的具體分子機制還不十分清楚。

本研究發現，缺氧的條件下培養PAJU細胞，更容易受到Aβ的毒性作用，其細胞的活力比單純的Aβ干預、單純的缺氧干預更低，其細胞形態受損更嚴重，說明缺氧可以促進Aβ的神經毒性。這與Egashira研究報道一致〔11〕。缺氧的條件下，可以加重Aβ的神經毒性作用，引起細胞形態和活性受損更加明顯。

本研究發現，PAJU-NEO細胞系與PAJU-ICAM-5細胞系分別予以相同的處理(缺氧、Aβ42、缺氧并Aβ42處理)后，倒置相差顯微鏡顯示:PAJU-ICAM-5細胞的突起長度明顯較PAJU-NEO細胞的突起長，雖經Aβ毒性作用，但無明顯損壞，細胞體相對較完整。同時，MTT法顯示:PAJU-ICAM-5的細胞存活率明顯高于PAJU-NEO細胞，提示ICAM-5在神經元內常量表達有助于促進神經元存活，提高其抵抗缺氧及Aβ42的神經毒性作用。

1 Sun XL，He GQ，Qing H，et al.Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2006;103(49):18727-32.

2 Li L，Zhang X，Yang D，et al.Hypoxia increases A beta generation by altering beta-and gamma-cleavage of APP〔J〕.Neurobiol Aging，2009;30(7):1091-8.

3 Zhang X，Zhou K，Wang R，et al.Hypoxia-inducible factor 1alpha(HIF-1alpha)-mediated hypoxia increases BACE1 expression and beta-amyloid generation〔J〕.J Biol Chem，2007;282(15):10873-80.

4 Gahmberg CG，Tian L，Ning L，et al.ICAM-5-a novel two-facetted adhesion molecule in the mammalian brain〔J〕.Immunol Lett，2008;117(2):131-5.

5 Berrocal M，Marcos D，Sepúlveda MR，et al.Altered Ca2+dependence of synaptosomal plasma membrane Ca2+-ATPase in human brain affected by Alzheimer's disease〔J〕.FASEB J，2009;23(6):1826-34.

6 Tomiyama T，Matsuyama S，Iso H，et al.A mouse model of amyloid beta oligomers:their contribution to synaptic alteration，abnormal tau phosphorylation，glial activation，and neuronal loss in vivo〔J〕.J Neurosci，2010;30(14):4845-56.

7 Boyd-Kimball D，Castegna A，Sultana R，et al.Proteomic identification of proteins oxidized by Abeta(1-42)in synaptosomes:implications for Alzheimer's disease〔J〕.Brain Res，2005;1044(2):206-15.

8 Simakova O，Arispe NJ.Early and late cytotoxic effects of external application of the Alzheimer's Abeta result from the initial formation and function of Abeta ion channels〔J〕.Biochemistry，2006;45(18):5907-15.

9 Agostinho P，Cunha RA，Oliveira C.Neuroinflammation oxidative stress and the pathogenesis of Alzheimer's disease〔J〕.Curr Pharm Des，2010;16(25):2766-78.

10 Erik Hjorth，Dan Frenkel，Howard Weiner，et al.Effects of Immunomodulatory Substances on Phagocytosis of Aβ1-42 by Human Microglia〔J〕.Int J Alzheimer Dis，2010;E Pub.

11 Egashira N，Iwasaki K，Ishibashi M，et al.Hypoxia enhances beta-amyloid-induced apoptosis in rat cultured hippocampal neurons〔J〕.Jpn J Pharmacol，2002;90(4):321-7.