ICAM-5對(duì)Aβ神經(jīng)毒性的保護(hù)作用

涂秋云 丁斌蓉 楊 霞 唐湘祁 (中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 4003)

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中和腦缺血后阿爾茨海默病(AD)的發(fā)生率顯著增加，缺氧是AD的病因之一〔1〕。但缺氧介導(dǎo)AD的病理過(guò)程的具體分子機(jī)制還不十分清楚。研究證實(shí)缺氧通過(guò)改變?chǔ)痢ⅵ潞挺梅置诿傅淖饔茫揎椀矸蹣忧绑w蛋白(APP)的加工過(guò)程，導(dǎo)致Aβ的生成顯著增加〔2〕，并且缺氧還可通過(guò)不同途徑增加APPβ位點(diǎn)裂解酶1(BACE1)的基因和蛋白表達(dá)，導(dǎo)致Aβ的生成顯著增加〔3〕。對(duì)于缺氧是否會(huì)增強(qiáng)Aβ的神經(jīng)毒性，或缺氧可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞抵抗Aβ神經(jīng)毒性的能力降低，目前還沒(méi)有研究報(bào)道。細(xì)胞間黏附分子5(ICAM-5)在神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)展中有重要作用，可促進(jìn)神經(jīng)元樹(shù)突生長(zhǎng)和突出可塑性改變〔4〕。在低氧的環(huán)境中，AD的發(fā)生率顯著增加，這些是否與神經(jīng)細(xì)胞在低氧環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)的ICAM-5出現(xiàn)變化，從而使細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制受損，Aβ對(duì)神經(jīng)元的毒性作用增強(qiáng)，導(dǎo)致AD的發(fā)生率增加呢?在缺氧環(huán)境中，ICAM-5是否對(duì)Aβ神經(jīng)毒性誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用呢?目前國(guó)內(nèi)外在這一方面尚未見(jiàn)研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(芬蘭赫爾辛基大學(xué)生命科學(xué)院 Carl G.Gahmberg教授贈(zèng)送的PAJU細(xì)胞);Aβ42(rPeptide公司);MTT(Sigma公司);DMEM powders(Gibco公司);胰蛋白酶粉(Amoresco公司);倒置相差光學(xué)顯微鏡(Nikon ELLIPSE TS100);低溫高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)。

1.2 方法

1.2.1 Aβ42的“老化”處理 以儲(chǔ)存濃度為231 μmol/L置于37℃的PBS中孵育7 d左右即為“老化”狀態(tài)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系PAJU-ICAM-5細(xì)胞及PAJU-NEO細(xì)胞分別以5×105/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，培養(yǎng)穩(wěn)定后，分組:①常態(tài)組:常態(tài)PAJU-NEO細(xì)胞及PAJU-ICAM-5細(xì)胞組，50 ml/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h;②Aβ干預(yù)組:將培養(yǎng)穩(wěn)定的PAJU-ICAM-5細(xì)胞及PAJU-NEO細(xì)胞予以濃度為1.0 nmol/L老化的Aβ42干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)96 h;③缺氧組:將常態(tài)PAJU-NEO細(xì)胞及PAJU-ICAM-5細(xì)胞置于缺氧環(huán)境(1% ～2%O2、5%CO2、93%N2培養(yǎng)箱)培養(yǎng) 96 h;④Aβ 干預(yù)+缺氧組:將常態(tài)PAJU-NEO細(xì)胞及PAJU-ICAM-5細(xì)胞予以濃度為1.0 nmol/L老化的Aβ42干預(yù)，并置于1% ～2%O2、5%CO2、93%N2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h。收取細(xì)胞樣品，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化、MTT法觀察細(xì)胞凋亡的情況。

1.2.3 MTT法觀察細(xì)胞 檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述各組細(xì)胞，于干預(yù)前1 d以5×104/孔接種于無(wú)菌的96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后再根據(jù)各組細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)一步按上述方法處理和培養(yǎng)至96 h，棄去培養(yǎng)基，加入5 g/L MTT 20 μl后繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，最后加入 150 μl DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A490 nm吸光度值。計(jì)算公式:細(xì)胞存活率=(試驗(yàn)組A490值－空白對(duì)照組A490值)/(陰性對(duì)照組A490值－空白對(duì)照組A490值)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各時(shí)間點(diǎn)中各組吸光度值均以±s表示，用析因分析對(duì)各時(shí)間內(nèi)各組吸光度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果 ①PAJU-NEO細(xì)胞分別經(jīng)Aβ42處理、缺氧處理后，細(xì)胞數(shù)量減少，突起變短、減少;缺氧并Aβ干預(yù)組的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，突起變短、減少、甚至消失。② PAJU-ICAM-5細(xì)胞分別經(jīng)Aβ42處理、缺氧處理后，神經(jīng)突起分支數(shù)目無(wú)明顯變化，僅突起變短、增粗，缺氧并Aβ干預(yù)組的細(xì)胞數(shù)量減少，突起變短。③PAJU-ICAM-5細(xì)胞的突起長(zhǎng)度明顯較PAJU-NEO細(xì)胞的突起長(zhǎng)(P＜0.05)，PAJU-ICAM-5細(xì)胞雖經(jīng)Aβ毒性作用，但無(wú)明顯變短和損壞，細(xì)胞體相對(duì)較完整。見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(×400)

2.2 MTT比色法顯示缺氧條件下Aβ42對(duì)PAJU細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組PAJU-NEO細(xì)胞24、48和96 h后，存活率依次為(0.98 ±0.11，0.94 ±0.15，0.92±0.23，n=3);經(jīng) Aβ42處理24、48和96 h后，PAJU-NEO細(xì)胞存活率依次為(0.78±0.13，0.57±0.21，0.37±0.14，n=3);經(jīng)缺氧處理24、48和96 h后，存活率依次為(0.82±0.17，0.67±0.24，0.63±0.14，n=3);同時(shí)經(jīng)Aβ42和缺氧處理24、48和96 h后，存活率依次為(0.65±0.11，0.51±0.11，0.31±0.10，n=3)，經(jīng)兩兩組間比較其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，另外，對(duì)照組與缺氧并Aβ42處理組間比較具有極顯著差異，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說(shuō)明缺氧、Aβ42對(duì)細(xì)胞存活具有一定的抑制作用，缺氧可以加重Aβ42對(duì)細(xì)胞存活的抑制作用，其抑制效應(yīng)呈時(shí)間依賴性。

PAJU-ICAM-5組細(xì)胞，在經(jīng)缺氧處理組、Aβ42處理組、缺氧并Aβ42處理組 24、48及 96 h后，細(xì)胞存活率依次分別為(0.99±0.11，0.97 ± 0.15，0.95 ± 0.23，n=3;0.89 ± 0.12，0.76 ±0.21，0.68 ±0.11，n=3;0.84 ±0.12，0.66 ±0.25，0.47 ±0.13，n=3;0.75 ± 0.13，0.68 ±0.11，0.52 ±0.19，n=3)，組間兩兩比較，對(duì)照組與低氧組、Aβ組比較，其凋亡率顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對(duì)照組與缺氧并Aβ42處理組比較，其凋亡率極顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);缺氧組與Aβ組比較，其凋亡率無(wú)顯著變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

PAJU-NEO細(xì)胞系與PAJU-ICAM-5細(xì)胞系分別予以相同的處理(缺氧、Aβ42、缺氧并Aβ42處理)后進(jìn)行組間凋亡率比較有顯著差異(P＜0.05)。

3 討論

研究表明Aβ神經(jīng)毒性涉及介導(dǎo)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元內(nèi)鈣超載、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、改變突觸功能等多個(gè)方面〔5～10〕。我們研究發(fā)現(xiàn)Aβ干預(yù)PAJU-NEO細(xì)胞及PAJU-ICAM-5細(xì)胞后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了一系列變化:PAJU-NEO細(xì)胞系細(xì)胞數(shù)量減少，突起變短、減少;PAJU-ICAM-5細(xì)胞系細(xì)胞數(shù)量減少，突起變短，但突起數(shù)量無(wú)明顯變化。同時(shí)，MTT法顯示Aβ干預(yù)組的細(xì)胞存活率較常態(tài)組降低，且細(xì)胞的存活率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，說(shuō)明Aβ可以降低細(xì)胞活性、誘導(dǎo)凋亡，進(jìn)而說(shuō)明Aβ的神經(jīng)毒性之一是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且其抑制效應(yīng)呈時(shí)間依賴性。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧作為一個(gè)獨(dú)立因素干預(yù)PAJU細(xì)胞后，PAJU-NEO細(xì)胞系細(xì)胞數(shù)量減少，突起變短、減少;PAJU-ICAM-5細(xì)胞系細(xì)胞數(shù)量減少，突起變短，神經(jīng)突起無(wú)明顯變化。同時(shí)，MTT法顯示缺氧組的細(xì)胞存活率較常態(tài)組降低，且細(xì)胞的存活率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，說(shuō)明缺氧作為獨(dú)立因素可以降低細(xì)胞活性、誘導(dǎo)其凋亡，且其抑制效應(yīng)呈時(shí)間依賴性。所以缺氧也可以導(dǎo)致神經(jīng)毒性，與目前的觀點(diǎn)缺氧是AD的重要危險(xiǎn)因素之一相符合，但缺氧介導(dǎo)AD的病理過(guò)程的具體分子機(jī)制還不十分清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧的條件下培養(yǎng)PAJU細(xì)胞，更容易受到Aβ的毒性作用，其細(xì)胞的活力比單純的Aβ干預(yù)、單純的缺氧干預(yù)更低，其細(xì)胞形態(tài)受損更嚴(yán)重，說(shuō)明缺氧可以促進(jìn)Aβ的神經(jīng)毒性。這與Egashira研究報(bào)道一致〔11〕。缺氧的條件下，可以加重Aβ的神經(jīng)毒性作用，引起細(xì)胞形態(tài)和活性受損更加明顯。

本研究發(fā)現(xiàn)，PAJU-NEO細(xì)胞系與PAJU-ICAM-5細(xì)胞系分別予以相同的處理(缺氧、Aβ42、缺氧并Aβ42處理)后，倒置相差顯微鏡顯示:PAJU-ICAM-5細(xì)胞的突起長(zhǎng)度明顯較PAJU-NEO細(xì)胞的突起長(zhǎng)，雖經(jīng)Aβ毒性作用，但無(wú)明顯損壞，細(xì)胞體相對(duì)較完整。同時(shí)，MTT法顯示:PAJU-ICAM-5的細(xì)胞存活率明顯高于PAJU-NEO細(xì)胞，提示ICAM-5在神經(jīng)元內(nèi)常量表達(dá)有助于促進(jìn)神經(jīng)元存活，提高其抵抗缺氧及Aβ42的神經(jīng)毒性作用。

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