不同劑量硝酸甘油預處理對缺血再灌注心肌的作用

王群英 劉新偉 楊海燕 何東偉 葉 茂 (重慶醫科大學附屬第一醫院麻醉科，重慶 40006)

缺血預處理(ischemic preconditioning，IPC)是目前人們研究最多也是經大量研究證實可減輕心肌缺血再灌注損傷的有效方法。研究發現，藥物預處理也能模擬缺血預處理的機制保護心肌，減輕心肌缺血再灌注(I/R)損傷。硝酸甘油是臨床最常使用的血管擴張劑，通過釋放NO，激活鳥苷酸環化酶(cGC)發揮作用。近年研究發現，硝酸甘油預處理能夠減輕心肌I/R損傷〔1〕，其作用主要是通過增加內源性NO的生成來實現的。NO的心肌保護作用呈劑量依賴性，適量增加缺血組織中NO的含量可以減輕損傷，大劑量則加重損傷。因此，NO供體預處理減輕心肌I/R損傷的量是值得探討的問題。因此，本文旨在尋找硝酸甘油的一個有效劑量，既不引起血流動力學的明顯波動，又能達到減輕心肌I/R損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 雄性SD大鼠32只，體重(275±11)g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供;K-H液(mmol/L:NaC1:118.5、NaHCO3:25.0、KC1:4.75、MgSO4:1.2、KH2PO4:1.2、CaC12:2.5、Glucose:11.1);硝酸甘油注射液:批號 090401L1910，山西康寶生物制品股份有限公司;一氧化氮試劑盒:南京建成生物工程研究所;BCA蛋白定量試劑盒:北京百泰克;cTnI試劑盒:RD公司;離體心臟灌流裝置:120101BEZ，Radnoti公司;恒溫循環器:9006AA2Y，Polyscience公司;RM 6240B型生理信號采集處理系統:成都儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 SD大鼠32只，隨機分為4組(n=8):I/R組、硝酸甘油 2 μg·kg－1·min－1硝酸甘油預處理(PC1)組、4 μg·kg－1·min－1硝酸甘油預處理(PC2)組、6 μg·kg－1·min－1硝酸甘油預處理(PC3)組。

1.2.2 實驗方法 大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛1 ml/100 g麻醉，仰臥固定于手術臺上，分離出頸動脈，插管，導管另一端與RM 6240B型生理信號采集處理系統相連，開啟系統，實時監測大鼠頸動脈血壓。采用臨床用24 G靜脈留置針進行尾靜脈穿刺，拔出針芯，見有明顯回血及試推生理鹽水通暢時，固定留置針，從尾靜脈留置針持續1 h泵入硝酸甘油。

1.2.3 藥物配置方法 小劑量配置方法:取硝酸甘油1支(規格:5 mg，1 ml)，稀釋50倍，再取稀釋后的硝酸甘油1 ml，稀釋10倍，配置成濃度為10 μg/ml的硝酸甘油，泵注1 h總量為1.2 ml/100 g;中劑量配置方法:取硝酸甘油一支(規格:5 mg，1 ml)，稀釋25倍，再取稀釋后的硝酸甘油1 ml，稀釋10倍，配置成濃度為20 μg/ml的硝酸甘油，泵注1 h總量為1.2 ml/100 g;大劑量配置方法:硝酸甘油2支，取其中1.2 ml，稀釋20倍，再取稀釋后的硝酸甘油1 ml，稀釋10倍，配制成濃度為30 μg/ml的硝酸甘油，泵注1 h，總量為1.2 ml/100 g。

1.2.4 大鼠離體心灌流模型的制備 大鼠腹腔注射肝素1 000 IU/kg，充分肝素化，打開胸腔，迅速取出心臟(剪斷主動脈時應遠離心臟)，置于95%O2～5%CO2混合氣飽和的4℃K-H液中，簡單修剪后迅速掛于Langendorff灌注裝置上，開啟灌注系統，灌注壓力約90 cmH2O，心臟逐漸恢復搏動，穩定搏動15 min后，切開左心耳，于左心室內置入帶水囊的導管，導管另一端與RM 6240B生理信號采集處理系統相連。心臟穩定搏動15 min，從主動脈灌注4℃冷停跳液2 ml/kg，灌注壓力約90 cmH2O，關閉灌注系統，心臟停跳，全心停跳30 min。重新開啟灌注系統，灌注95%O2～5%CO2混合氣飽和的37℃ K-H液90 min。

1.3 檢測指標 實時監測大鼠用藥前及用藥期間動脈血壓的變化情況，并分別于缺血前、再灌注5、15、30 min，記錄左室收縮壓(LVSP)、左心室壓力變化率(±dp/dtmax)和心率(HR)、冠脈流量(CF)的變化情況。再灌注結束，取左心室心肌組織測心肌肌鈣蛋白(cTnI)的釋放情況及NO含量。

2 結果

2.1 動脈血壓變化趨勢 PC1與PC2、PC3組比較，PC1組用藥前及用藥期間平均動脈壓(MAP)平穩，無明顯波動，PC3組MAP明顯下降，PC2組MAP有所降低，但是與PC1組差異不明顯。見表1。

表1 各組用藥前后MAP比較(n=8，±s)

表1 各組用藥前后MAP比較(n=8，±s)

與用藥前比較:1)P＜0.05

時間 PC1組 PC2組 PC3組用藥前99.2±1.68 100.6±2.75 98.9±1.85用藥30 min 97.7±2.18 86.0±1.251) 65.8±1.171)

2.2 心功能、冠脈流量變化情況 與I/R組比較，PC1組HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯升高，CF 明顯增加;PC3組 HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低、CF 明顯減少;PC2組較 I/R 組明顯升高(P＜0.05)，但較PC1組無顯著性差異(P＞0.05)。見表2，表3。

2.3 心肌組織中cTnI及NO含量的變化 與I/R組比較，PC1組cTnI明顯降低(P＜0.05)，PC3組較 PC1、PC2組均明顯增高，PC2組cTnI也明顯增加，但較PC3組比較明顯降低。與I/R組比較，PC1組NO明顯增加(P＜0.05)，PC3組NO大量增加(P＜0.05)，PC3組NO 較 PC1組大量增加(P ＜0.05)，PC2組NO較I/R組也明顯增加(P＜0.05)，但較PC3組明顯降低(P＜0.05)。見表4。

表2 各組心功能比較(n=8，±s)

表2 各組心功能比較(n=8，±s)

與I/R組比較:1)P＜0.05

指標 組別 缺血前 再灌注5 min 再灌注15 min 再灌注30 min HR(次/min) I/R組212.9±9.5 182.9±9.5 178.3±5.90 171.0±7.3 PC1組 214.8±10.4 191.0±9.01) 187.5±9.71) 182.4±11.51)PC2組 208.9±12.3 187.1±7.4 183.3±7.7 177.9±9.2 PC3組 208.3±11.5 176.3±4.71) 171.4±6.51) 161.9±8.61)LVSP(mmHg) I/R組 184.4±13.05 154.4±6.57 150.9±6.56 139.4±6.52 PC1組 186.3±10.99 168.4±14.611) 165.6±13.451) 159.1±14.671)PC2組 182.8±13.77 159.6±14.10 155.0±15.15 149.3±15.91 PC3組 186.8±15.59 143.5±12.661) 136.1±13.231) 126.9±14.881)+dp/dtmax(mmHg/s) I/R組 1 628±80.19 1 117±83.65 1 074±88.28 1 022±91.86 PC1組 1 670±77.49 1 290±91.621) 1 254±86.571) 1 209±79.861)PC2組 1 655±70.69 1 194±97.56 1 142±102.84 1 110±107.18 PC3組 1 644±57.55 1 012±110.021) 960±107.921) 910±109.991)-dp/dtmax(mmHg/s) I/R組 1 537±65.78 1 017±82.76 973±81.61 934±86.35 PC1組 1 563±80.11 1 183±85.781) 1 134±86.191) 1 091±85.281)PC2組 1 555±72.02 1 097±101.21 1 058±95.83 1 007±98.46 PC3組 1 542±53.63 913±106.441) 866.9±114.381) 813±117.351)

表3 各組CF比較(ml/min，n=8，±s)

表3 各組CF比較(ml/min，n=8，±s)

與I/R組比較:1)P＜0.05

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表4 各組心肌組織中cTnI和NO含量比較(n=8，±s)

表4 各組心肌組織中cTnI和NO含量比較(n=8，±s)

與I/R組比較:1)P＜0.05;與PC1組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.05

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3 討論

研究發現:無論是內源性還是外源性的NO都能保護心肌，減輕I/R損傷〔2〕。缺血預處理引起eNOS的激活，進而使內源性NO生成增加，進一步引起心肌保護作用。研究發現過度表達eNOS在缺血中可以提高內源性NO含量從而引起心肌保護〔3〕;外源性給予NO供體如SNAP可以模擬預處理的保護機制，減輕心肌I/R損傷，且其保護作用在一定范圍內呈劑量依賴性，近生理濃度時保護作用最明顯，劑量過高時則產生毒性作用。NO的心肌保護作用主要通過影響活性氧的生成及蛋白激酶C(PKC)的激活，并在線粒體水平抑制線粒體呼吸鏈的電子傳遞及抑制線粒體滲透性轉運孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)〔4〕的開放等發揮作用。臨床相關的 NO供體如硝酸甘油，也具有強大的心肌保護作用。

硝酸甘油在體內代謝產生1，2-二硝基甘油(1，2-GDP)和亞硝酸鹽(NO-2)，亞硝酸鹽在線粒體內進一步代謝生成NO，亞硝酸鹽作為體內NO的一種儲存形式，在近生理劑量時具有強大的心肌保護作用〔5〕。研究發現:給予亞硝酸鹽使缺血時體內血藥濃度達到2.4～960 nmol/L時呈劑量依賴性的保護作用，在接近生理濃度48 nmol/L時的保護效果最明顯。隨后的研究證實并拓展了研究成果:亞硝酸鹽治療可以通過局部或全身給予預處理心肌組織〔6〕。近來發現:硝酸甘油預處理可以減輕心肌I/R損傷，在大鼠心肌經歷I/R前1 d靜脈持續1 h給予硝酸甘油2 μg·kg－1·min－1(總量 120 μg/kg)預處理可顯著降低心肌梗死面積及室顫室速等的發生，其機制和PKC及mKATP的激活有關〔7〕。有研究報道:在麻醉誘導時用微量泵持續泵入硝酸甘油 0.25 ～1 μg·kg－1·min－1可以明顯降低冠心病病人圍術期心肌壞死標志物肌鈣蛋白(cTnI)的水平〔8〕，減輕心肌損傷。

因此，本實驗以 2 μg·kg－1·min－1的劑量作為研究切入點，設計了大、中、小不同劑量(6、4、2 μg·kg－1·min－1)，研究不同劑量的硝酸甘油對心肌組織的作用，研究結果發現:小劑量(2 μg·kg－1·min－1)硝酸甘油持續 1 h 靜脈泵入對大鼠MAP 無明顯影響，中劑量(4 μg·kg－1·min－1)與之比較差異不明顯，大劑量(6 μg·kg－1·min－1)則明顯降低大鼠 MAP，明顯影響大鼠血流動力學穩定。與I/R組比較，PC1組在各個監測時間點的心功能有明顯改善，PC3組明顯降低，PC2組無顯著性變化;與PC1組比較，I/R組心肌組織中NO含量明顯降低，PC2組明顯升高，PC3組極顯著升高，表明小劑量硝酸甘油(2 μg·kg－1·min－1)預處理可以顯著減輕心肌 I/R 損傷，其可能機制是通過提高I/R心肌組織NO的含量達到的。大劑量(6 μg·kg－1·min－1)則加劇損傷，其可能機制是使心肌組織NO生成過度增加，進而激發NO對心肌組織的損傷作用。而4 μg·kg－1·min－1可能是臨界劑量，但由于實驗劑量選擇不是連續性的，可能存在偏差，但是實驗結果與引用文獻一致:NO供體在治療疾病的同時，必須考慮其量的問題。

綜上所述，小劑量硝酸甘油(2 μg·kg－1·min－1)預處理可以減輕心肌I/R損傷，大劑量硝酸甘油(6 μg·kg－1·min－1)預處理加劇損傷，4 μg·kg－1·min－1預處理則心肌損傷無明顯差異。在心肌組織缺血時，NO的含量明顯降低，小劑量硝酸甘油預處理對心肌的保護作用可能是通過增加心肌組織NO的生成達到的，但是作為NO供體，在臨床使用時必須考慮到其量的問題，NO生成過多則會加重心肌組織的損傷。

1 Mchael H，Hitossi T，Tang X-L，et al.Nitroglycerin induces late preconditioning against myocardial infarction in conscious rabbits despite development of mtrate tolerance〔J〕.J Circ，2001;104:694-9.

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3 du Toit EF，Genade S，Carlini S，et al.Efficacy of ischemic preconditioning in the eNOS overexpressed working mouse heart model〔J〕.Eur J Pharmacol，2007;556:115-20.

4 Wang G，Liem DA，Vondriska TM，et al.Nitric oxide donors protect murine myocardium against infarction via modulation of mitochondrial permeability transition〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005;288(3):1290-5.

5 Baker JE，Su J，Fu X，et al.Nitrite confers protection against myocardial infarction:role of xanthine oxidoreductase，NADPH oxidase and K(ATP)channels〔J〕.Mol Cell Cardiol，2007;43:437-44.

6 Shiva S，Sack MN，Greer JJ，et al.Nitrite augments tolerance to ischemia/reperfusion injury via the modulation of mitochondrial electron transfer〔J〕.J Med，2007;204:2089-102.

7 Babak Baharvand，Mansour Esmaili Dehaj，Bahram Rasoulian，et al.Delayed anti-arrhythmic effect of nitroglycerin in anesthetized rats:Involvement of CGRP，PKC and mKATP channels〔J〕.Intern J Cardiol，2009;135:187-92.

8 方傳奇，王存真，李建中，等.硝酸甘油對冠心病病人圍術期心肌肌鈣蛋白I的影響〔J〕.中原醫刊，2006;33(24):25-6.