靈芝多糖對卵巢癌小鼠的保護作用及其機制

曲紅光 曲洪源 高 磊 王 麗

(吉林大學白求恩醫學院病原生物學教研室 吉林大學真菌研究中心，吉林 長春 130021)

卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位。卵巢癌的治療以手術為主，并輔以化療和放療的綜合治療。對于大多數患者主要采用手術與化療聯合治療，但是由于化療藥物嚴重的毒副作用，極大地限制了其臨床應用的范圍及效果，因此臨床治療中尋找一種低毒、安全、副作用小的抗腫瘤藥物以提高療效，成為近年來研究的熱點。目前，對中藥活性成分的篩選及其作用的研究得到了廣泛關注〔1，2〕。本研究從中藥靈芝中提取靈芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharides，GLP)，研究其對卵巢癌小鼠的治療作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系來源和實驗動物 卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌順鉑耐藥細胞系(SKOV-3/DDP)由吉林大學病原微生物學真菌中心構建。ICR清潔級小鼠102只，體重18～22 g，雌性，由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(吉)2009-0001。

1.1.2 藥物與試劑 DMEM-F12培養基(Hyclone);特級胎牛血清(FCS)(Biosource);青鏈霉素(SM-PC)(Hyclone);二甲基亞砜(DMSO)(Sigma);四甲基耦氮唑藍(MTT)(Sigma);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒和CAT試劑盒;GLP(吉林大學病原生物學·真菌研究中心制備)。

1.1.3 儀器 倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司生產;GFD200型半自動生化分析儀，山東高密彩虹分析儀器公司生產;LDZ-2型自動平衡離心機，北京醫用離心機廠生產。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SKOV-3/DDP細胞貼壁生長在含10%～20%胎牛血清及100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEMF12培養基中。培養均在5%CO2、飽和濕度及37℃培養條件下進行。實驗用細胞均處于對數生長期。

1.2.2 觀察免疫抑制小鼠狀態和小鼠外周血白細胞水平 取12只5～6周齡的ICR雌性小鼠，體重18～20 g，25℃飼養，正常食水。飼養5 d后將小鼠隨機分為兩組，每組6只。第一組為空白組，每日腹腔注射生理鹽水0.2 ml，連續5 d。第二組為免疫抑制組，每日腹腔注射200 mg/kg環磷酰胺(CTX)，每只0.2 ml，連續5 d，誘導小鼠免疫抑制。每次在行注射前采用微量采血器尾靜脈采血，顯微鏡下計數每立方毫米血液中白細胞總數。通過觀察白細胞減少程度確定小鼠是否受到免疫抑制。

1.2.3 建立小鼠腹腔種植瘤模型 取10只同前免疫抑制小鼠，實驗首日腹腔注射1×108個細胞/ml SKOV-3/DDP細胞0.2 ml，以后每天測量小鼠體重，觀察小鼠一般生存狀態。2 w后脫臼處死全部小鼠，剪開皮膚，暴露腹腔，肉眼觀察腹腔種植瘤和腹水情況。

1.2.4 構建小鼠卵巢原位種植瘤模型 在無菌條件下，取上述SKOV-3/DDP成瘤小鼠1只，將小鼠10%水合氯醛0.05 ml/10 g麻醉后，取出瘤體，4℃無菌生理鹽水漂洗后切成1 mm×1 mm×1 mm組織塊待用。取20只上述免疫抑制小鼠隨機分為二組，每組10只。空白組:10%水合氯醛0.05 ml/10 g麻醉小鼠，以左或右側肋骨與股骨之間靠近脊椎骨約0.8 cm處平行脊椎縱行切口，長約1 cm，暴露腹腔，尋找右側子宮、輸卵管和卵巢。小鼠卵巢內注射生理鹽水0.05 ml后關腹，分籠飼養7 d，創口愈合后，將同組實驗動物合籠飼養3 w。SKOV-3/DDP組:麻醉及手術同前，待找到卵巢后，在解剖顯微鏡下，用眼科手術剪刀剪開卵巢包膜后，取上述備好的SKOV-3/DDP腹腔種植瘤組織小塊縫入卵巢，關腹后，飼養同前。次日開始觀察各組小鼠體重、飲食及一般生存狀態。4 w后脫臼處死小鼠，解剖肉眼觀察卵巢原位腫瘤生長情況。

1.2.5 采用半自動生化分析儀檢測血清SOD、GSH-Px和CAT含量的變化，觀察靈芝多糖對SKOV-3/DDP腫瘤球卵巢癌原位移植瘤的療效 取60只前述ICR免疫抑制小鼠，以SKOV-3/DDP細胞建立小鼠原位移植瘤模型。將小鼠隨機分為六組，每組10只。空白組，接種腫瘤當日起每日尾靜脈注射生理鹽水0.4 ml;DDP組，接種腫瘤當日起每日按8 mg/kg腹腔注射無菌DDP溶液，注射體積0.4 ml;GPL對照組，接種腫瘤當日起每日尾靜脈注射GPL 0.4 ml(100 mg/kg);GPL低劑量組，接種腫瘤當日開始，每日尾靜脈注射GPL 0.2 ml(50 mg/kg);GPL中劑量組，接種腫瘤當日開始，每日尾靜脈注射 GPL 0.2 ml(100 mg/kg);GPL高劑量組，接種腫瘤當日開始，每日尾靜脈注射GPL 0.2 ml(200 mg/kg)。以上GPL三個劑量組同時按8 mg/kg腹腔注射無菌DDP溶液，注射體積0.2 ml。以上每組藥物均連續注射2 w。全部小鼠給藥次日開始每天觀察小鼠飲食、一般生存狀態并測量體重，最后一次注射后3 d脫臼處死小鼠，測量移植瘤最長徑(L)和最短徑(W)，稱瘤重，按公式:V=(L×W2)/2，計算腫瘤體積;按公式:(V治療后-V治療前)/V治療前，計算腫瘤生長指數。所有小鼠眥靜脈取血離心待用，觀察藥物作用前后各組小鼠血清生化學指標SOD、GSH-Px、CAT含量的變化。

1.3 統計學分析 用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 小鼠免疫抑制模型的建立 注射CTX后，免疫抑制組小鼠第1、2、3、4、5天白細胞總數與非免疫抑制組比較有顯著差異(P＜0.05)。非免疫抑制組小鼠白細胞數未見波動。見表1。

2.2 GLP對SKOV-3/DDP腫瘤原位移植瘤的作用 GPL對照組和GPL中、低劑量組及DDP組SOD、GSH-Px、CAT含量較空白組均一定程度升高，但無統計學差異(P＞0.05);高劑量組各指標含量升高明顯，與空白組相比有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

表1 小鼠外周血白細胞水平(n=6，±s，mm－3)

表1 小鼠外周血白細胞水平(n=6，±s，mm－3)

與空白組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

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表2 各組藥物對小鼠血清SOD、GSH-Px和CAT含量的影響 (n=10，± s，U/L)

表2 各組藥物對小鼠血清SOD、GSH-Px和CAT含量的影響 (n=10，± s，U/L)

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3 討論

在腫瘤實驗研究中，根據疾病的表型特征，考慮到生物和遺傳因素的影響，建立合理的動物模型非常重要。SKOV-3細胞為人卵巢癌細胞，不易感染小鼠，而有報道其可以感染免疫缺陷或免疫抑制小鼠。本實驗通過CTX誘導小鼠免疫抑制，建立卵巢癌的腹腔種植瘤模型和卵巢原位移植模型進行研究〔3，4〕。

CTX是氮芥與磷酰胺基結合而成的化合物，臨床常用于治療各種自身免疫性疾病，可抑制細胞增殖、非特異性殺傷抗原敏感性小淋巴細胞;其主要副作用為骨髓抑制，表現為白細胞減少。所以在實驗中檢測白細胞水平，可以作為判斷小鼠免疫抑制是否成功的主要手段之一。體內動物實驗表明，SKOV-3/DDP腫瘤侵染小鼠的卵巢癌移植瘤模型，更能真實地模擬卵巢癌體內生長的轉移模式〔5〕。GPL作用于卵巢癌原位移植瘤動物，檢測各給藥組血清SOD、GSH-Px和CAT的含量變化，結果證實，GPL對卵巢癌小鼠具有保護作用，并增強其對化療藥物的敏感性。綜上所述，本研究以人卵巢癌SKOV-3細胞系的DDP耐藥細胞株SKOV-3/DDP為研究對象，建立卵巢癌原位移植瘤體內模型，研究GPL及GPL+DDP聯合用藥對卵巢癌DDP耐藥小鼠的治療，認為GPL對卵巢癌小鼠具有保護作用，與化療藥物聯合應用，可以增強對化療藥物的敏感性，為提高卵巢癌的化療效果開辟了廣闊的應用前景。

1 黃芳華，商明紅，熊亞婷，等.低分子靈芝多糖體內抗腫瘤活性研究及其作用機制探討(英文)〔J〕.中國天然藥物，2010;3:228-32.

2 李曉冰，徐 荔，劉 彪，等.中藥多糖抗腫瘤作用研究進展〔J〕.中國中醫基礎醫學雜志，2010;7:632-4.

3 陳偉強，黃際薇，羅利瓊，等.靈芝多糖調節糖尿病大鼠血糖、血脂的實驗研究〔J〕.中國老年學雜志，2005;25(8):957-8.

4 周 婷，榮風年.丙戊酸對卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤生長抑制作用的研究〔J〕.醫學綜述，2010;21:29-31.

5 王 薇，高慶蕾.上皮性卵巢癌組織中金屬硫蛋白與肺耐藥蛋白的表達及意義〔J〕.中國實用婦科與產科雜志，2004;20(3):152-4.