法尼醇X受體在高甘油三酯血癥大鼠腎臟的表達(dá)和定位

胡志娟 劉 冰 任路平 李 凡 孫 文 宋光耀 (河北省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 05005)

當(dāng)今飲食結(jié)構(gòu)的變化致使果糖的攝入量逐年增加。果糖代謝導(dǎo)致甘油三酯(TG)的甘油和?；糠置黠@增多，導(dǎo)致脂質(zhì)從頭合成以及TG合成的速率明顯增強(qiáng)〔1〕。脂質(zhì)腎毒性學(xué)說(shuō)認(rèn)為，在一些情況下，循環(huán)中的脂質(zhì)可能直接損害腎小球結(jié)構(gòu)，高脂血癥在啟動(dòng)腎小球損害至腎小球硬化的過(guò)程中是一個(gè)重要的加重因素〔1〕。法尼醇X受體(farnesoidreceptor，F(xiàn)XR)在肝臟、腎臟、腎上腺和小腸組織中高表達(dá)，同時(shí)還存在于脂肪組織、心臟、脾臟和血管平滑肌中〔2〕。FXR參與機(jī)體內(nèi)膽汁酸的代謝、脂代謝和糖代謝，并起著重要的調(diào)節(jié)作用〔3〕。本研究采用高果糖飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠高TG血癥，觀察腎組織脂質(zhì)的蓄積、腎臟病理形態(tài)的變化以及FXR的表達(dá)和定位，并通過(guò)膽汁酸治療進(jìn)一步探討脂質(zhì)腎毒性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立與分組 健康雄性Wistar大鼠32只(由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室提供)，體重200 g左右，隨機(jī)分成正常對(duì)照組(N組)及高果糖組(F組)，每組16只。正常對(duì)照組為普通飼料，高果糖組中果糖占熱量的34.5%。每日記大鼠進(jìn)食量，每周記大鼠體重。喂養(yǎng)8 w及16 w時(shí)各處死大鼠8只，大鼠處死前一天采用代謝籠收集24 h尿標(biāo)本，處死時(shí)留取血標(biāo)本。腎臟經(jīng)生理鹽水充分灌洗后稱(chēng)重，部分組織以10%甲醛固定、石蠟包埋，制成3 μm厚切片，其余組織液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生化測(cè)定 大鼠處死時(shí)以3%戊巴比妥腹腔注射麻醉各組大鼠(2 ml/100 g)，右側(cè)頸動(dòng)脈取血標(biāo)本約8 ml。血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、空腹血糖(FPG)及血脂的測(cè)定在Beckman全自動(dòng)生化分析儀上完成。24 h尿微量白蛋白(24 h UMA)定量采用免疫比濁法。

1.3 腎皮質(zhì)脂質(zhì)提取及TG測(cè)定 以3%戊巴比妥腹腔注射麻醉各組大鼠(2 ml/100 g)，用0.1 mmol PBS緩沖液進(jìn)行左腎灌洗，灌洗速度為10 ml/min，PBS總量為50 ml，灌洗后腎臟呈灰白色，分離腎皮質(zhì)，取200 mg皮質(zhì)按Macala〔4〕等方法進(jìn)行脂質(zhì)提取及定量分析。

1.4 腎組織病理檢測(cè) 經(jīng)10%甲醛固定的腎組織石蠟包埋，制成3 μm厚的切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化行PAS染色。腎組織5 μm冰凍切片行油紅O脂質(zhì)染色。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)FXR的表達(dá) 10%甲醛固定、石蠟包埋的腎組織進(jìn)行3 μm厚的連續(xù)切片。二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，熱修復(fù)140℃、2 min;3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗2 min×3;滴加兔抗FXR抗體(美國(guó)，Santa Cruz)，4℃過(guò)夜，PBS 沖洗2 min×3;再依此加入聚合物輔助劑和辣根酶標(biāo)記的兔抗IgG工作液，37℃孵育20 min，每個(gè)步驟后均PBS沖洗，2 min×3。DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片鏡檢。PBS(磷酸鹽)緩沖液替代一抗作陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 左腎重/體重(KW/BW)、腎功能、血脂、FPG及24 h UMA比較 與對(duì)照組比較，8 w及16 w高果糖組大鼠KW/BW、BUN、Scr、膽固醇(TC)及FPG變化無(wú)明顯差異(P＞0.05);TG、極低密度脂蛋白(VLDL)及24 h UMA在高果糖組明顯升高(P＜0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)其水平均增加。見(jiàn)表1。

2.2 腎皮質(zhì)TG含量 與對(duì)照組〔8 w:(4.30±0.76)mg/g，16 w:(5.16±1.70)mg/g〕比較，高果糖組腎皮質(zhì) TG含量〔8 w:(7.21±2.20)mg/g，16 w:(7.92±3.05)mg/g〕明顯增加(P＜0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)其水平均增加。

表1 各組大鼠左腎重/體重、腎功能、血脂、FPG及24 h UMA比較(± s，n=8)

表1 各組大鼠左腎重/體重、腎功能、血脂、FPG及24 h UMA比較(± s，n=8)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05

對(duì)照組 8 w 3.11±0.27 6.46±0.50 33.75±3.28 1.50±0.210.79±0.31 0.40±0.14 5.19±0.58 20.00±6.00 16 w 3.34±0.56 6.59±1.37 41.39±6.39 1.66±0.14 1.09±0.36 0.50±0.16 5.45±0.47 45.00±24.00高果糖組 8 w 3.38±0.22 6.54±0.66 42.56±8.25 1.59±0.20 1.65±0.861)0.75±0.391) 5.84±0.56 63.00±12.001)16 w 3.63±0.41 6.69±0.85 45.57±3.67 1.82±0.65 2.13±0.871)0.97±0.401) 6.01±0.37 150.00±48.001)

圖1 各組大鼠腎組織PAS染色(×200)

圖2 各組大鼠腎組織油紅O染色(×200)

圖3 各組大鼠腎組織中FXR免疫組織化學(xué)表達(dá)(×200)

2.3 腎臟病理改變 光鏡下可見(jiàn)(PAS染色)高果糖組大鼠腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)彌漫增生，腎小管上皮空泡及顆粒變性，隨時(shí)間延長(zhǎng)，病變加重，腎間質(zhì)及小血管未見(jiàn)明顯病變。油紅O染色可見(jiàn)高果糖組腎小球及近端腎小管內(nèi)油紅O染色陽(yáng)性，隨時(shí)間延長(zhǎng)，病變加重，提示中性脂質(zhì)進(jìn)行性蓄積。見(jiàn)圖1、圖2。

2.4 腎組織FXR的表達(dá) FXR在正常大鼠腎臟組織中主要分布在近曲小管，高果糖組大鼠FXR在上述區(qū)域的表達(dá)顯著下調(diào)，隨病程延長(zhǎng)，表達(dá)減弱。見(jiàn)圖3。

3 討論

果糖同葡萄糖相比，更能誘導(dǎo)膽固醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和肝臟脂質(zhì)從頭合成〔1〕。果糖對(duì)機(jī)體的危害有:肥胖、加速衰老、胰島素抵抗、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥(視網(wǎng)膜病變、腎臟疾病、神經(jīng)疾病)、非酒精性脂肪肝、高甘油三酯血癥、高尿酸血癥、慢性腹瀉、腸應(yīng)激綜合征、蕁麻疹〔5〕。

腎臟疾病時(shí)常常伴有高TG血癥，研究發(fā)現(xiàn)血清TG水平與尿蛋白排泄率、腎小球?yàn)V過(guò)率的下降有顯著相關(guān)性〔6〕，提示TG以及富含TG的脂蛋白具有腎毒性作用。脂質(zhì)在腎臟沉積，在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腎臟固有細(xì)胞增生和損傷、細(xì)胞外基質(zhì)積聚及泡沫細(xì)胞形成等過(guò)程中，直接或間接地導(dǎo)致腎小球硬化。

本研究中，經(jīng)過(guò)8 w高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠高TG血癥及高VLDL血癥而血糖水平無(wú)明顯升高;16 w時(shí)，大鼠的上述指標(biāo)升高更為明顯而血糖水平仍無(wú)顯著差異，提示脂代謝紊亂往往出現(xiàn)在糖代謝紊亂之前。本研究發(fā)現(xiàn)，高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠在腎皮質(zhì)亦出現(xiàn)TG的蓄積，表現(xiàn)在腎皮質(zhì)TG含量增加以及油紅O染色可見(jiàn)陽(yáng)性的細(xì)胞，隨時(shí)間延長(zhǎng)，上述指標(biāo)水平升高。高果糖組大鼠在實(shí)驗(yàn)8 w時(shí)出現(xiàn)尿微量白蛋白水平顯著增加，該指標(biāo)是早期腎損害較為敏感的指標(biāo)，提示腎臟損傷。PAS染色可見(jiàn)高果糖組大鼠腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)彌漫增生，腎小管上皮空泡及顆粒變性，隨時(shí)間延長(zhǎng)，病變加重，腎間質(zhì)及小血管未見(jiàn)明顯病變。

FXR是1995年首先克隆和命名的，在肝臟、小腸、腎臟和腎上腺高表達(dá)，在脂肪和心臟中低表達(dá)，F(xiàn)XR蛋白有典型的核受體結(jié)構(gòu)〔2〕。FXR的生物學(xué)主要進(jìn)展是發(fā)現(xiàn)膽汁酸可以作為此核受體的內(nèi)源性配體，生理濃度下的多種初級(jí)和次級(jí)膽汁酸以及一些多不飽和脂肪酸可激活FXR〔7〕。FXR參與膽汁酸代謝，參與調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝，與多種疾病密切相關(guān)。

在脂代謝過(guò)程中，F(xiàn)XR能調(diào)節(jié)磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(phospholipid transfer protein，PLTP)的表達(dá)，加速磷脂和膽固醇從富含TG的脂蛋白向高密度脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)〔8〕;FXR還能上調(diào)肝細(xì)胞膜上的清道夫受體B(cavenger receptor B1，SR-B1)，從而增加高密度脂蛋白介導(dǎo)的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)〔9〕。FXR能通過(guò)調(diào)控脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)、微粒體TG轉(zhuǎn)移蛋白 (microsomal triglyceride transfer protein，MTP)，調(diào)節(jié)TG代謝。人體內(nèi)，F(xiàn)XR可調(diào)控過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)活性，膽汁酸激活 FXR可通過(guò) SHP下調(diào)SREBP-1c的表達(dá)最終使血漿中TG含量減少〔10〕。因此，激活FXR就能夠降低TG，從而對(duì)腎臟起保護(hù)作用。

本研究免疫組織化學(xué)表明，F(xiàn)XR在正常大鼠腎臟組織中主要分布在近曲小管，高果糖組大鼠FXR在上述區(qū)域的表達(dá)顯著下調(diào)，隨病程延長(zhǎng)，表達(dá)減弱。表明腎臟的固有細(xì)胞均參與了腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，高果糖飲食可導(dǎo)致大鼠高TG血癥并使健康大鼠出現(xiàn)顯著的腎臟病理?yè)p害。因此，選擇健康的生活方式，積極控制高TG血癥對(duì)防治或延緩腎臟疾病進(jìn)行性惡化具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 Andersson CX，Gustafson B，Hammarstedt A，et al.Inflamed adipose tissue，insulin resistance and vascular injury〔J〕.Diabetes Metab Res Rev，2008;24(8):595-603.

2 Zhang Y，Kast-Woelbern HR，Edwards PA.Natural structural variants of the nuclear receptor farnesoidreceptor affect transcriptional activation〔J〕.J Biol Chem，2003;278:104-10.

3 Zhang Y，Edwards PA.FXR signaling in metabolic disease〔J〕.FEBS Lett，2008;582(1):10-8.

4 Macala LJ，Yu RK，Ando S.Analysis of brain lipids by high performance thin-layer chromatography and densitometry〔J〕.J Lipid Res，1983;24(9):1243-50.

5 Johnson RJ，Sanchez-Lozada LG，Nakgawa T.The effect of fructose on renal biology and disease〔J〕.J Am Soc Nephrol，2010;21(12):2036-9.

6 Vaziri ND，Norris K.Lipid disorders and their relevance to outcomes in chronic kidney disease〔J〕.Blood Purif，2011;31(1-3):189-96.

7 Wang H，Chen J，Hollister K，et al.Endogenous bile acids are ligands for the nuclear receptor FXR/BAR〔J〕.Mol Cell，1999;3:543-53.

8 Sirvent A，Verhoeven AJ，Jansen H，et al.Farnesoidreceptor represses hepatic lipase gene expression〔J〕.J Lipid Res，2004;45:2110-5.

9 Lambert G，Amar MJ，Guo G，et al.The farnesoid X-receptor is an essential regulator of cholesterol homeostasis〔J〕.J Biol Chem，2003;278:2563-70.

10 Pineda Torra I，Claudel T，Duval C，et al.Bile acids induce the expression of the human peroxisome proliferator-activated receptor alpha gene via activation of the farnesoidreceptor〔J〕.Mol Endocrinol，2003;17:259-72.