載TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦對MG63細胞功能的影響

陳良建 ，汪瑞芳，郭小平，李益民，何浩，李挺

(1. 中南大學 湘雅三醫院，湖南 長沙，410013；

2. 中南大學 粉末冶金國家重點實驗室，湖南 長沙，410083)

種植義齒已逐漸成為修復牙缺失的主流技術?，F有的牙種植體多為全致密型，尚存如下不足：未提供骨組織長入的結構條件，骨整合形成時間長(需 3～6月)，初期穩定性低，種植體表面涂層易受植入剪切力破壞失效等。多孔種植體能提供骨質長入種植體的結構，實現生物固定，其力學性能與骨質相匹配，是新型種植體的研究熱點。當前鈦種植體改性研究多著力于改善種植體與細胞的親和力，促進鈣磷沉積和新骨生成，缺乏種植體與周圍細胞和組織的深層互動。若新型鈦種植體能主動動員周圍細胞，啟動并強化成骨信號，加快種植體周圍骨組織的改建與整合，則有利于提高種植體初期的穩定性和成功率。已有研究證實局部應用生長因子可以促進骨髓基質細胞向成骨細胞分化，提高堿性磷酸酶活性和增加骨橋素mRNA的表達[1?2]。但生長因子直接局部應用存在擴散較快、易被蛋白酶分解、半衰期短等缺陷[3]。生長因子有效濃度和作用時間的維持是局部應用的前提。本文作者用明膠微球作為生長因子的緩釋系統，通過體外細胞實驗研究載 TGF-β1緩釋明膠微球涂層的多孔鈦試樣對成骨細胞功的影響，并優化明膠微球載TGF-β1作用濃度。

1 材料和方法

1.1 載TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦的制備

1.1.1 多孔鈦的制備

用粉末注射成形技術制備孔隙率為60%，孔徑為50～300 μm，呈連通孔結構多孔鈦[4]。用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲波清洗各10 min。于溫度為60 ℃的烘干箱中干燥，高溫高壓消毒后備用。

1.1.2 載TGF-β1明膠微球的制備

用改良乳化冷凝聚合交聯法制備粒徑為 10～40 μm的明膠緩釋微球[1]。每1 mg干燥微球中分別加入0.5，5，50，500 mg/L 的 TGF-β1溶液各 5 μL，在 4 ℃，pH=7.4條件下，保持24 h，充分溶脹后離心(1 200～1 500 r/min)15 min, 雙蒸水洗滌2次，凍干，鈷-60照射滅菌封存。

1.1.3 載TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦的制備

用質量分數為 5%的明膠溶液浸泡多孔鈦，負壓條件下處理10 min，50 ℃干燥6 h。用無水乙醇配制質量分數為20 mg/mL TGF-β1明膠微球懸液涂敷多孔鈦表面，用質量分數為 2.5%的戊二醛溶液浸泡試樣30 min后，用無水乙醇清洗3次，每次10 min，冷凍干燥，鈷-60照射滅菌封存。

1.2 細胞毒性實驗(MTT法)

將試樣按0.2 g/mL的比例浸泡于含10%小牛血清的RPMI 1640培養基中，在細胞培養箱中浸提72 h后，收集浸提液于4 ℃保存。將L929細胞懸液按2.5×104個/mL接種于96孔細胞培養板(200 μL/孔)，培養24 h。材料組取濃度分別為100%，50%和10%(體積分數，下同)的浸提液交換原培養液，每組設6個平行孔。陰性對照組為含10%小牛血清的新鮮RPMI1640培養基，陽性對照組加入10 μL濃度為8 mol/L的苯酚溶液，繼續培養3 d。加入噻唑藍(MTT)溶液，繼續培養4 h，棄上清，加入二甲基亞砜，振蕩，用酶聯免疫儀于波長490 nm下測其吸光度。

1.3 體外釋藥實驗

隨機選用載 TGF-β1濃度分別為0.025，0.25，2.5，25 mg/g明膠微球涂層多孔鈦試樣各3個，置于無菌24孔細胞培養板，加入2 mL的1640培基，置于培養箱中24 h后，取浸提液后4 ℃保存，即為釋放24 h的待測浸提液。以同樣方法留取 2，4，6，8，10和12 d的浸提液于4 ℃保存。按TGF-β1ELISA試劑盒的操作說明，用酶聯免疫儀于450 nm波長下測定浸出液吸光度，與TGF-β1標準曲線對照，計算各時間點樣本 TGF-β1濃度，繪制TGF-β1釋放曲線。

1.4 優化明膠微球載TGF-β1濃度

用載不同濃度 TGF-β1明膠微球與 MG63細胞復合培養，通過檢測載 TGF-β1明膠微球對 MG63細胞的增殖和分化影響，優化其濃度。

1.4.1 細胞增殖檢測

用0.25%胰酶消化MG63細胞, 用含12%胎牛血清的1640培養基配制細胞濃度為5×104個/mL的細胞懸液。接種于24孔板內，培養24 h待細胞貼壁，加配制的載TGF-β1濃度分別為0.025，0.250，2.500，25.000 mg/g明膠微球2 mg，對照組不加生長因子的微球2 mg，設3個復孔，分別培養3，7和14 d。按SunBioTMAm-Blue細胞增殖與活性檢測試劑說明書操作，在波長490 nm下分光光度酶標儀測定各孔有吸光度并記錄，參照標準曲線，計算細胞增殖數。

1.4.2 細胞分化檢測

取置于離心管中第3，7，14 天的培養液, 按堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒說明書(南京建成生物工程工程所第一分所)進行操作，用酶聯免疫儀測定各孔吸光度并記錄，參照標準曲線，計算ALP的活性。

1.5 載TGF-β1明膠微球涂層的多孔鈦試樣對MG63細胞的影響

1.5.1 細胞增殖的評價

設置3組實驗，實驗組為載2.5 mg/g TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦，對照組為直接用 100 μL 10 mg/L TGF-β1溶液滴至多孔鈦表面，未處理組為不加TGF-β1多孔鈦試樣，設3個復孔，以0.25%胰酶消化MG63細胞，以10%小牛血清的 1640培養基調整至濃度為4.0×104個/mL的懸液，取2 mL細胞懸液接種于放有3組試樣的24孔培養板內培養，分別在第3，7和14天，按SunBioTMAm-Blue細胞增殖與活性檢測試劑說明書操作，在波長490 nm下分光光度酶標儀測定各孔吸光度并記錄，參照標準曲線，計算細胞增殖數。

1.5.2 黏附形貌檢測

試樣與MG63細胞復合培養，分別在第7和第14天吸去培養液，再加入4 ℃預冷的2.5%戊二醛固定，于4 ℃保存。用酒精梯度脫水，臨界點干燥，噴金，掃描電鏡檢測MG63細胞在多孔鈦表面的黏附形貌。

1.5.3 細胞分化評價

堿性磷酸酶(ALP)：試樣與 MG63細胞復合培養3，7，14 d后，收集各孔上清液，按ALP測定試劑盒說明書(南京建成生物工程工程所第一分所)進行操作，用酶聯免疫儀測定各孔吸光度并記錄，參照標準曲線，計算ALP的活性。

骨鈣素(BGP)：試樣與MG63細胞復合培養3，7和14 d后，收集各孔上清液，按碘[125I]骨鈣素反射免疫分析藥盒(北京普爾偉業生物科技有限公司)說明書進行操作，用放射性檢測儀測定各孔放射性計數值并記錄，參照標準曲線，計算BGP活性。

1.6 統計分析

選用SpSS13.0統計軟件包，數據用平均值()±標準差(s)表示(±s)，采用單因素方差分析，P＜0.05時，差異有顯著性。

2 結果

2.1 載TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦表面形態

載TGF-β1明膠微球及其涂層多孔鈦SEM圖如圖1和2所示?？梢姡狠dTGF-β1明膠緩釋微球呈圓球型,粒徑較均勻，表面光滑，未見微孔和裂紋。多孔鈦的表面和孔隙壁上沉積了明膠微球涂層。

2.2 細胞毒性試驗

實驗細胞為 L929 細胞，3個實驗組分別為濃度100%，50%，10%的浸提液、陰性對照組和陽性對照組。復合培養3 d 后，采用MTT 法檢測試樣細胞毒性，用490 nm 酶聯免疫檢測儀測定吸光度，用吸光度計算相對增殖率(R)，R=De/Dn×100%。式中：De為試驗組的吸光度；Dn為陰性對照組的吸光度。按R進行細胞毒性分級(CTS)，見表1。由表1 看出，3 種濃度的浸提液的R值與陽性對照組比較差異均較顯著(p＜0.05)，CTS分級均為0～Ⅰ級，明膠緩釋微球涂層多孔鈦試樣無細胞毒性，符合《醫療器械生物學評價國家標準GB/T 16886.1—2001》中對材料細胞毒性的要求。

圖1 載TGF-β1明膠微球SEM圖Fig.1 SEM image of TGF-β1 loaded gelatin microspheres

圖2 載TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦SEM圖Fig.2 SEM image of porous titanium coated with TGF-β1 loaded gelatin microspheres

表1 明膠微球涂層多孔鈦對L929細胞毒性結果Table 1 Results of cytotoxicity tests of porous titanium coated with TGF-β1 loaded gelatin microspheres with L929 cells

2.3 體外釋放實驗

生長因子的擴散速度和載體材料的降解速度，明膠微球在堿性條件下完全降解約需 2月，體液pH=7.35～7.45，符合明膠微球降解的條件。用不加血清的細胞培養液為釋放介質，按 TGF-β1ELISA試劑盒的操作說明。不同TGF-β1濃度的明膠緩釋微球涂層多孔鈦體外釋放曲線如圖3所示。從圖3可看出：初期釋放速度較快，24 h內達到20%～30%，其釋放量與載TGF-β1的濃度相關，第3天時累計釋放量達40%；隨時間增加，釋放速度減緩，第8天時，4種濃度試樣釋放速率接近一致，第12天時累計釋放量為93%。

圖3 不同TGF-β1含量的明膠緩釋微球涂層多孔鈦體外釋放曲線Fig.3 Release profile of porous titanium coated with different concentration TGF-β1 loaded gelatin microspheres

2.4 載TGF-β1明膠微球作用濃度的優化

2.4.1 TGF-β1濃度對細胞增殖影響

MG63細胞與載 TGF-β1明膠微球復合培養 3，7和14 d后，按SunBioTMAm-Blue細胞增殖與活性檢測試劑說明書操作。MG63細胞在不同濃度TGF-β1下培養3，7和14 d時增殖的比較如圖4所示。從圖4可看出：同一時間點不同濃度TGF-β1明膠微球對MG63細胞的增殖影響不同，TGF-β1濃度在0.025～0.25 mg/g范圍內，TGF-β1的濃度與MG63細胞增殖呈劑量正效應關系，當 TGF-β1濃度為 25 mg/g時，TGF-β1對MG63細胞增殖有抑制作用。

2.4.2 TGF-β1濃度對細胞分化影響

MG63細胞與載TGF-β1明膠微球復合培養3，7，14 d后，按ALP試劑盒操作。MG63細胞在不同濃度TGF-β1下培養3，7和14 d時ALP的活性如圖5所示。從圖5可看出：在0.025～2.5 mg/g范圍內，TGF-β1濃度對 MG63細胞分化呈劑量正效應關系，載 TGF-β1濃度為2.5 mg/g時，明膠微球對MG63細胞分化促進作用優于其他4組。

圖4 MG63細胞在不同含量TGF-β1下培養3，7，14 d時增殖的比較Fig.4 Comparison of cell proliferation of MG63 and different concentration of TGF-β1 after cultured 4, 7 and 14 d

圖5 MG63細胞在不同濃度TGF-β1下培養3，7和14 d時ALP的活性Fig.5 ALP activity of MG63 cells and different concentration of TGF-β1 after cultured 3, 7 and 14 d

2.5 載TGF-β1明膠微球涂層對成骨細胞功能的影響

2.5.1 細胞增殖

3組試樣與MG63細胞復合培養3，7和14 d，按SunBioTMAm-Blue試劑盒操作。3組多孔鈦試樣與MG63細胞培養復合3，7和14 d后細胞增殖的比較如圖6所示?？梢姡涸谂囵B3和7 d時，實驗組成骨細胞數量最多，對照組其次，未處理組最少，第 14天時，實驗組高于其他2組，而對照組與未處理組細胞增殖數量差別無顯著性。

2.5.2 黏附形貌

圖6 3組多孔鈦試樣與MG63細胞培養復合3，7和14 d后細胞增殖的比較Fig.6 Comparison of cell proliferation of MG63 and three groups porous titanium samples after cultured 3, 7 and 14 d

3組試樣與MG63細胞復合培養7和14 d后，掃描電鏡檢查 MG63細胞試樣表面黏附細胞數量與形貌。3組試樣與MG63細胞復合培養7和14 d 的表面形貌如圖7所示?？梢姡? d時，實驗組試樣表面細胞數相對較多，細胞形態不規則，偽足多，細胞附著在孔隙邊緣，有向孔隙內遷移趨勢(圖7(a))；對照組試樣表面黏附的MG63細胞數量比實驗組少，細胞伸展良好，細胞跨過小孔隙形成細胞橋(圖7(c))；未處理組試樣表面黏附細胞比實驗組和對照組均少，細胞呈梭形，偽足少(圖7(e))。14 d時，3組試樣表面的細胞均生長良好，細胞多呈不規則多邊形，實驗組細胞偽足伸至微球表面，伸展良好，細胞緊貼孔隙側壁和底壁生長，細胞跨越孔隙連接成片，呈疊瓦狀結構(圖7(b)；對照組試樣表面黏附細胞的形貌與實驗組相似，細胞跨越孔隙連接成片生長(圖 7(d))；未處理組細胞緊貼孔壁和孔底壁生長，但未形成疊瓦狀結構(圖7(f))。從上述結果可看出，試樣與MG63細胞復合培養7 d時，實驗組試樣表面黏附細胞數量明顯多于對照組和未處理組，細胞形態不規則，偽足多；14 d時，實驗組和對照組試樣表面黏附細胞數量均明顯多于未處理組，細胞跨越孔隙生長連接成片，呈疊瓦狀結構黏附在孔隙側壁和底壁，未處理組試樣表面黏附的細胞無此特點。

圖7 3組試樣與MG63細胞復合培養7和14 d 的表面形貌Fig.7 Surface morphologies of MG63 cells cultured for 7 d and 14 d on three groups porous titanium samples

2.5.3 細胞分化

(1) ALP的檢測。3組試樣與MG63細胞復合培養3，7和14 d后，用ALP試劑盒檢測培養液中ALP活性。3組試樣與MG63細胞復合培養3，7和14 d后ALP的活性如圖8所示。從圖8可見：培養3和7 d時，實驗組與對照組中 ALP活性均高于未處理組的ALP活性，與未處理組比較差異有顯著性(P＜0.05)，而實驗組與對照組間比較差異無顯著性(P＞0.05)；14 d時，實驗組ALP活性高于對照組ALP活性，而對照組ALP活性高于未處理組ALP活性，組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。

(2) 骨鈣素檢測。3組試樣與MG63細胞復合培養3，7，14 d后，用骨鈣素試劑盒檢測培養液中骨鈣素(BGP) 活性，結果如圖9所示。從圖9可見：培養3和7 d時，實驗組和對照組的BGP活性均高于未處理組的BGP活性，與未處理組的BGP活性比較差異有顯著性(P＜0.05)，而實驗組與對照組間差異無顯著性(P＞0.05)；14 d時，實驗組的BGP活性高于對照組BGP活性，對照組BGP活性高于未處理組BGP活性，組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。由上述ALP和BGP的檢測結果可知，多孔鈦試樣用TGF-β1處理后有利于MG63細胞的分化，載TGF-β1明膠微球涂層對MG63細胞的作用優于直接用TGF-β1溶液組。

圖8 3組試樣與MG63細胞復合培養3，7和14 d后ALP的活性Fig.8 ALP activity of MG63 cells and three groups porous titanium samples after cultured 3, 7 and 14 d

圖9 3組試樣與MG63細胞復合培養3，7和14 d后BGP活性Fig.9 BGP activity of MG63 cells and three groups porous titanium samples after cultured 3, 7 and 14 d

3 討論

鈦和鈦合金因具有良好力學性能和生物相容性，已被廣泛應用于骨科的人工關節假體及牙種植體。鈦生物活性差，鈦植入體植入后形成骨整合時間一般需3～6 月。改善鈦種植體表面的生物活性，加快骨整合形成是新型種植體的研究熱點。局部應用促骨組織形成的生長因子是種植體表面改性的策略之一。已有研究證實在骨替代材料表面吸附多種生長因子可以促進成骨細胞的分化、基質分泌及鈣化，包括促進有絲分裂因子(如IGF-1)，增強骨細胞活性的因子(如TGF-β1)和誘導成骨的因子(如BMPS 等)[1]。TGF-β1有促成骨和成軟骨作用，改變骨膜的細胞構成，誘導礦化的骨形成[5?6]。外源性生長因子存在穩定性低、生物膜透過性差、半衰期短、局部直接應用在體內很快被稀釋和分解等不足。藥物緩釋系統具有緩釋藥物、靶向輸送、在保證藥物治療作用的前提下減少給藥劑量、降低藥物毒性等優點[7]。局部采用緩釋系統緩釋生長因子能解決上述不足，但選用的載體材料和合適生長因子作用濃度目前尚存爭議。適用于制備緩釋系統的材料有聚乳酸、明膠、殼聚糖等，聚乳酸在體內降解產物為乳酸，可致局部發生炎癥反應[8?9]。本研究選用明膠為緩釋材料，明膠的組織相容性好，能自然降解，降解產物不引起組織炎癥反應[10]，是由氨基酸與肽類交聯形成的直鏈聚合物，能進行多種表面修飾及反應，且含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)生物活性短肽，可與細胞表面受體結合，有利于細胞表面黏附分子識別[11]；生長因子為多肽結構，當溶脹于明膠微球中，明膠能與多肽形成氫鍵，能穩定多肽的天然構象，從而保持生長因子活性，明膠微球被包裹藥物釋放速度相對緩慢，能達到緩釋的要求[12?13]。本課題組已采用改良乳化冷凝聚合交聯法優化了明膠微球制備工藝[14]，本研究在此基礎上優化明膠載 TGF-β1濃度，研究載 TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦試樣對成骨細胞的影響。

種植體植入骨內10～12 d后，成骨細胞在種植體骨界面開始分化成骨，12～18 d成骨細胞活性增強，骨界面開始骨改建[15]。對種植體表面進行生物化改性，促進界面早期成骨細胞募集和分化，有利于骨整合形成。TGF-β1促進已被募集來的成骨細胞合成Ⅰ型膠原、纖維結合蛋白，具有抑制破骨細胞的活化，刺激成骨母細胞的增殖和活化等作用[10,16]，呈劑量依賴性促進骨源性間充質細胞向軟骨分化，TGF-β1濃度對軟骨細胞有促進或降低分化的雙重調節作用[17]。在種植體表面用TGF-β1進行表面改性，將有利于促進早期啟動骨愈合程序，有利于骨整合形成，但目前局部應用生長因子的最佳暴露時間和最佳濃度尚無定論。一般認為低濃度TGF-β1促進細胞增殖，而高濃度抑制細胞增殖[18]。有研究發現TGF-β1濃度在0.01～1.00 mg/L范圍內，隨劑量增加對成骨細胞的增殖作用也增強，質量濃度為1～10 mg/L時，促細胞增殖作用不明顯，質量濃度大于10 mg/L時表現為對細胞增殖的抑制作用[19]，而也有研究認為 TGF-β1在低濃度(小于 0.01 mg/L)時可促進成骨細胞的增殖，大于0.01 mg/L時隨著濃度的增加，促增殖作用明顯減弱[4]。本研究體外實驗發現：載 TGF-β1明膠微球與 MG63細胞復合培養，TGF-β1濃度為0.025 mg/g的明膠微球對MG63細胞增殖無明顯作用，25 mg/g時對MG63細胞增殖有抑制作用，濃度在 0.25～2.5 mg/g范圍時，對 MG63細胞增殖和分化均有促進作用，對細胞增殖呈劑量正效應關系，TGF-β1濃度為2.5 mg/g的明膠微球對細胞增殖作用最優。

材料表面形貌和粗糙度、表面化學組成、親水性、表面能和表面電荷影響細胞黏附。粗糙的表面結構、良好的表面化學組成與親水性、高表面能和適合的表面電荷有利于成骨細胞的黏附[20?21]。本研究發現載TGF-β1明膠微球涂層和直接涂敷 TGF-β1的多孔鈦試樣與MG63細胞復合培養7和14 d后，試樣表面黏附的數量、細胞形態、伸展狀況均優于未處理的多孔鈦試樣，培養7 d時，實驗組試樣表面黏附的細胞數量明顯多于對照組。實驗組對MG63細胞黏附和增殖作用優于B和未處理組，可能與以下因素有關：明膠是由氨基酸與肽類交聯形成的直鏈聚合物，含有能與細胞表面整合素受體結合的生物活性短肽(RGD)，有利于細胞表面黏附分子識別[11]，對細胞黏附有利；表層孔隙內沉積載TGF-β1明膠微球，可持續釋放TGF-β1，能維持TGF-β1濃度相對穩定，有利于細胞在試樣表面募集，促進細胞合成分泌細胞外基質，為細胞黏附提供條件。在3和7 d時，對照組試樣對MG63細胞的增殖和黏附作用優于未處理的未處理組試樣，而14 d時，對照組試樣表面黏附細胞的數量和形貌均優于未處理組，但對細胞的增殖作用兩組間差異無顯著性?？赡苁怯捎趯φ战M試樣的直接涂覆的 TGF-β1短時間內大量稀釋到培養基，而TGF-β1半衰期短，易水解，維持有效作用濃度時間不長；TGF-β1促進早期黏附的MG63合成分泌細胞外基質，為后期MG63細胞進一步黏附提供基礎。

堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(BGP)是評價成骨細胞分化的指標，ALP是成骨細胞早期分化的指標，BGP是成骨細胞晚期分化指標，主要在礦化形成期分泌。本研究發現 TGF-β1局部應用對 MG63細胞的分化有利，在3和7 d時，涂覆載TGF-β1明膠微球涂層的實驗組試樣和直接添加 TGF-β1液的對照組試樣培養液中ALP和BGP的活性均高于未處理組的ALP和BGP活性，在14 d時，實驗組培養液中ALP和BGP的活性高于對照組的ALP和BGP活性，對照組的ALP和BGP活性高于未處理組的ALP和BGP活性。可能原因是：多孔結構建立了細胞黏附的良好微環境，微球持續釋放有效濃度生長因子，高密度的細胞黏附可誘導快速的聚集和分化；細胞形態的改變也可促進細胞分化[21]。從上述結果得知：載 TGF-β1明膠微球涂層對MG63細胞分化作用優于直接涂覆TGF-β1的試樣。

4 結論

(1) 多孔鈦表層孔隙內載TGF-β1明膠微球涂層具有緩釋作用，體外釋放持續時間約12 d，涂層無細胞毒性。

(2) TGF-β1濃度影響MG63細胞的功能，TGF-β1濃度為 0.25～2.5 mg/g范圍的明膠微球有利于 MG63細胞的增殖和分化，且呈劑量正效應關系, 濃度為2.5 mg/g的TGP-β1作用效果最佳，濃度低于0.25 mg/g的效果不明顯，濃度高于2.5 mg/g時抑制增殖，但不影響分化。

(3) 載TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦試樣對MG63細胞黏附、增殖和分化的作用優于直接應用 TGF-β1和未處理的試樣。載TGF-β1微球涂層試樣在3，7和14 d 3個時間段均能有效促進MG63細胞的增殖和分化；直接涂覆TGF-β1溶液的試樣在3和7 d時有促進細胞增殖作用，14 d時效果不明顯。

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