siRNA沉默CD147基因對肝癌細胞的影響

趙先勝，任志群

(1.浙江省寧波市傳染病醫院，浙江 寧波 315010; 2.西安交通大學醫學院第一附屬醫院肝病科，陜西 西安 710061)

腫瘤的侵襲生長是一個多因素、多步驟的過程，細胞外基質(主要是Ⅳ型膠原蛋白)不僅是腫瘤細胞賴以生存的場所，還是腫瘤細胞遷徙的天然屏障。CD147又被稱為促細胞外基質金屬蛋白酶因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)或basigin，在腫瘤細胞表面高度表達，刺激腫瘤細胞周圍的成纖維細胞分泌基質金屬蛋白酶(MMP)。研究發現，CD147在多種腫瘤中高表達，同時MMP活性增加，與腫瘤的浸潤和轉移密切相關。筆者通過下調CD147基因表達來觀察肝癌細胞增殖及凋亡的改變，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

含有人 U6啟動子的 pSilencerTM4.1－CMV neo質粒(美國Ambion公司);大腸桿菌DH5α(大連寶生物工程有限公司);限制性內切酶(Bam HⅠ，HindⅢ)、T4 DNA連接酶(美國 NEB公司);DNA marker(大連寶生物工程有限公司);質粒小量抽提試劑盒(天為時代公司);膠回收試劑盒(廣州美津生物公司);Lipofectamine 2000轉染試劑盒、G418(美國 Invitrogen公司);內參 β－actin、CD147單克隆抗體(美國R＆D公司)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的制備

根據美國基因序列數據庫中報道的CD147基因核苷酸序列(NM_198589)，輸入Ambion公司的在線siRNA設計軟件，軟件將自動分析和顯示候選siRNA。根據文獻[3－4]報道的siRNA設計原則和經驗，進一步在候選siRNA中篩選最佳者。設計的siRNA由上海吉凱基因化學技術有限公司合成，引物序列見正義鏈:5'－AGCTTAAGACCTTGGCTCCAAGATACTCTCTTGAAGTATCTTGGAGCCAAGGTCG－3';反義鏈:5'－GATCCGACCTTGGCTCCAAGATACTCAAGAGAGTATCTTGGAGCCAAGGTCTTA － 3'。

1.2.2 CD147/siRNA表達載體的構建及鑒定

參照Ambion公司說明書，將合成的siRNA連接至pSilencerTM4.1－CMV neo質粒，轉化至DH5α感受態細胞，挑選陽性克隆，用質粒小量抽提試劑盒小量提取質粒后，載體CD147/siRNA經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，樣本送檢行DNA測序。

1.2.3 細胞轉染與篩選

細胞培養條件為10%胎牛血清、100 g/L青霉素和100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養基于37℃和5%CO2條件下培養。轉染前24 h用2.5 g/L胰蛋白酶消化人HepG2細胞，具體操作按Invitrogen公司轉染試劑盒Lipofectamin2000操作說明書進行。

1.2.4 蛋白印記試驗檢測CD147基因表達

用蛋白裂解液RIPA裂解HepG2細胞，測定蛋白濃度，行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉印至硝酸纖維素膜，10%BSA血清封閉液中封閉1 h，然后鼠抗人－CD147單克隆抗體(1∶500)4℃孵育過夜，TBST液清洗3次，每次10 min，而后再與辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體(1∶5 000)室溫孵育2 h，在暗室中，采用化學發光反應試劑盒進行發光，暗室曝光。

1.2.5 MTT 法測定細胞活性

取對數生長的穩定轉染細胞的各組細胞，每孔按濃度為5×103個/mL接種于96孔培養板上，接種后48 h，用MTT法分別測定每孔光密度，各組細胞均設6個復孔，取平均值計算細胞活性。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

轉染后的肝癌細胞加入培養緩沖液，按Immuno－tech公司的說明書進行，1×106個/mL細胞用冰PBS液洗2次，調整細胞濃度為 1×106個 /mL，加 5 μL Annexin V 液(1∶10稀釋)和 5 μL 碘化丙錠(250 μg/mL 于 490 μL 細胞懸液中，冰浴放置 10 min，用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 重組載體的鑒定

結果見圖1。采用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切重組載體，12%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，可見55 bp處有明顯條帶(圖1 A)，相應部位測序后證實堿基序列和設計序列一致(圖1 B)，表明載體構建正確。

圖1 限制性內切酶鑒定CD147/siRNA重組表達載體及重組質粒測序

2.2 siRNA對CD147蛋白表達的影響

結果見圖2。穩定轉染后，siRNA組表達量明顯下降，但未處理的HepG2組及轉化的空質粒組表達量無明顯變化。

圖2 各位細胞中CD147蛋白表達情況

2.3 MTT法檢測各組細胞活性

結果見圖3。siRNA組細胞生長受到明顯影響 (P＜0.05)，空白對照組及空質粒之間細胞增殖情況無顯著性差異(P ＞0.05)。

圖3 MTT法檢測48 h后各組細胞活性

2.4 細胞凋亡檢測結果

轉染siRNA組的細胞的凋亡率顯著增加(14.85 ±1.35)%，與未轉組(4.51±0.36)%、轉染空 siRNA 載體組(6.13% ±0.71)%比較，差異有顯著性(P＜0.05)，說明沉默CD147基因表達可增加細胞的凋亡。

3 討論

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)所引起的序列特異性基因沉默，siRNA是21－23 nt小片段雙鏈RNA，可以特異性和互補靶基因mRNA序列結合，誘導其降解，產生強大的RNA干擾效應[1－2]。siRNA與靶序列之間嚴格的堿基配對，具有很強的特異性，它可以在染色質水平、轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平中參與基因表達的調節。盡管RNAi的效果看似和靶序列與siRNA的結合性有關，但目前并沒有可靠的方法來預判或鑒別RNAi的理想靶序列[3]。有報道指出，化學合成和載體介導的siRNA在哺乳動物細胞，包括惡性腫瘤細胞中都能成功地沉默特定的基因[4]。

Biswas等[5]將CD147分子純化后，發現CD147能體外誘導成纖維細胞合成 MMP－1，MMP－2，MMP－3。隨后對 CD147研究發現，在骨巨細胞瘤、泌尿系腫瘤、肺癌、乳腺癌、結直腸癌、口腔鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、成釉細胞癌、子宮內膜癌、骨髓癌、皮膚基底細胞癌、黑色素瘤、皮膚鱗狀細胞癌等腫瘤細胞中均發現CD147表達升高，同時MMP活性增加，且與腫瘤的浸潤和轉移相關[6]。在后續的一些研究中，人們發現CD147分子亦可作為評價多種惡性腫瘤預后的一個指標[6]，其高表達往往提示腫瘤的預后不良。

肝癌因其惡性程度高、預后差，一直受到人們的關注，其藥物治療已經有了很大的進展[7]。中醫藥也已有一定作用，但總體效果欠佳[8]。筆者根據美國基因序列數據庫中報道的CD147基因核苷酸序列，參考siRNA設計原則設計出了兩條針對CD147基因表達的RNAi序列，并成功克隆至載體CD147/siRNA，試驗證明它能下調肝癌細胞CD147蛋白的表達，抑制腫瘤細胞的增殖，誘導肝癌細胞的凋亡。提示抑制CD147基因表達，是肝癌治療的一個靶點，為肝癌的基因治療提供了可能。

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