唇裂防護膏微生物限度檢查法研究

任安民，楊曉莉，周志云

(陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710061)

唇裂防護膏屬于軟膏劑類，是將藥物均勻分散于蜂蠟、凡士林、固體石蠟、液體石蠟等油脂性基質中形成的油包水型制劑，供口唇涂抹以產生局部或全身性作用。唇裂防護膏是第四軍醫大學口腔醫院自行研制的外用化妝品類軟膏制劑，供邊疆高原戰士預防口唇干裂之用。根據2010年版《中國藥典(二部)》[1]要求，軟膏劑應進行微生物限度檢查，規定細菌數不得過100/g、霉菌和酵母菌數不得過100/g;不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。但目前對化妝品類軟膏劑尚無檢查方法學驗證與標準規定，為使檢測結果科學、準確，檢測前應進行方法學驗證。對于軟膏劑類的微生物限度檢查，需要解決兩個問題，一是制備供試液時對劑型的乳化[2]，二是人為加入已知菌的檢出回收率。筆者對此進行了研究，現報道如下。

1 實驗材料

隔水式培養箱(重慶萬達WGP－600.200.11382);真菌培養箱(上海一恒LRH－250－1786X);隔水式培養箱(重慶萬達WGP－600.200.11381)。環境條件為潔凈度10 000級下局部100級的單向流空氣區域。試驗菌種有枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]，金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，大腸埃希菌[CMCC(B)44102]，銅綠假單胞菌[CMCC(B)63501]，黑曲霉[CMCC(F)98003]白色念珠菌[CMCC(F)98001]，均由中國醫學細菌保藏中心提供。試藥試劑均由北京三藥科技開發公司生產，營養瓊脂培養基(批號為080922)，改良馬丁液體培養基(批號為0810203)，營養肉湯培養基(批號為080624)，玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號為0810233)，膽鹽乳糖增菌液(批號為0805282)，均按規定進行適應性檢查;稀釋液為pH=7.0的氯化鈉－蛋白胨緩沖液[按2010年版《中國藥典(二部)》方法配制];乳化劑(5 g司盤－80和5 g吐溫－80研磨混勻，加稀釋液至100 mL);乳化中和劑(取5 g司盤－80、5 g吐溫－80混勻，加入3 g卵磷脂，充分研磨至乳白色乳膏狀，少量多次研磨，加入蒸餾水稀釋至100 mL)。

2 方法與結果

2.1 方法驗證試驗[3－4]

2.1.1 試驗菌液制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌至營養肉湯培養基中，于(33±2)℃培養24 h;接種白色念珠菌至改良馬丁培養基中，于(25±2)℃培養48 h;接種黑曲霉菌至改良馬丁瓊脂斜面，于(25±2)℃培養7 d(用0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫孢子，標準管比濁)。以上培養物均用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含50～100 CFU的菌懸液備用。

2.1.2 供試液制備

取供試品5 g，加乳化劑100 mL，45℃水浴振搖，制備成1∶20的A供試液。取供試品5 g，加中和劑100 mL，45℃水浴振搖，制備成1∶20的B供試液。

2.1.3 預試驗方法

試驗組:取A供試液、B供試液加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌50～100 CFU，采用平皿法進行細菌數測定。結果見表1。

對照組:按A供試液、B供試液制備方法，不加供試品，制備對照液，同時加入試驗組試驗菌50～100 CFU，采用平皿法測定乳化劑與中和劑對細菌回收率的影響。

供試品組:取A供試液、B供試液，不加試驗菌，采用平皿法進行供試品本身細菌數測定。

菌液組:測定所加的試驗菌數。

2.1.4 預試驗結果

結果見表1。可見，A供試液、B供試液對照組回收率均大于70%，A供試液試驗組大腸埃希菌與金黃色葡萄球菌的回收率均小于B供試液試驗組。因此，可選擇B供試液中和劑組進行方法學驗證的細菌數測定。

表1 方法預試驗各組菌落均數測定結果

2.2 方法學驗證

2.2.1 中和劑平皿法菌數回收率測定

取供試品5 g，加中和劑100 mL，45℃水浴振搖，制備成1∶20的供試液。分別加入各試驗菌液，采用平皿法進行菌數回收率測定。試驗組取1∶20的供試液1 mL和試驗菌50～100 CFU，采用平皿法進行細菌、霉菌和酵母菌數測定。供試品組按試驗組方法，不加試驗菌，測定供試品的本底菌數。菌液組測定所加的試驗菌數。對照組取中和劑1 mL和試驗菌50～100 CFU，測定中和劑回收率。各組均進行重復試驗3次。結果見表2。可見，試驗組細菌、真菌的回收率均大于70%，中和劑對照組各菌的回收率均大于70%。因此，可采用中和劑平皿法進行細菌、霉菌和酵母菌數測定。

表2 細菌、霉菌和酵母菌回收率試驗結果

2.2.2 控制菌檢查方法驗證

試驗組:取2.2.1項下供試液20 mL和大腸埃希菌的試驗菌液1 mL，加入到膽鹽乳糖增菌液100 mL中，依據大腸埃希菌的檢查法試驗;取2.2.1項下供試液20 mL和金黃色葡萄球菌的試驗菌液1 mL，加入到營養肉湯培養基100 mL中，依據金黃色葡萄球菌的檢查法試驗;取2.2.1項下供試液20 mL和銅綠假單胞菌的試驗菌液1 mL，加入到膽鹽乳糖增菌液100 mL中，依據銅綠假單胞菌的檢查法試驗。

陰性對照組:取2.2.1項下供試液20 mL和金黃色葡萄球菌的試驗菌液1 mL，加入到膽鹽乳糖增菌液100 mL中，依據大腸埃希菌的檢查法試驗;取2.2.1項下供試液20 mL和大腸埃希菌的試驗菌液1 mL，加入到營養肉湯培養基100 mL中，依據金黃色葡萄球菌的檢查法試驗;取2.2.1項下供試液20 mL和大腸埃希菌的試驗菌液1 mL，加入到膽鹽乳糖增菌液100 mL中，依據銅綠假單胞菌的檢查法試驗。結果見表3。

可見，試驗組檢出大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，陰性對照組未檢出陰性對照菌。

表3 控制菌檢查方法驗證試驗結果

3 討論

軟膏劑包括滅菌型與非滅菌型制劑，前者是指用滅菌的藥物與基質在無菌環境條件下，按無菌操作規程進行配制的劑型，主要用于治療眼黏膜或皮膚黏膜疾病以及手術、燒傷與嚴重創傷的局部給藥[5]，2010年版《中國藥典(二部)》規定其應符合無菌檢查法規定;后者指用適宜基質混合，容易涂抹皮膚、黏膜或創傷面的外用半固體劑型，主要用于對皮膚的保護與滑潤[5]，雖然對生產制劑環境未進行嚴格規定，但也應嚴格控制其微生物污染，2010年版《中國藥典(二部)》對其微生物限度進行了明確的規定。第四軍醫大學口腔醫院研制的唇裂防護膏，主要用于對高原部隊官兵和高寒哨卡官兵在缺氧、寒冷、干燥氣候條件下所出現的口唇干裂、凍裂的防護與保護，故要求對其按藥典品種檢查。本試驗經對已知菌的回收率與控制菌的檢測，結果表明，以上方法經驗證符合2010年版《中國藥典》規定，可以作為該產品的檢測方法與質量標準。

本制劑按2010年版《中國藥典(二部)》附錄微生物限度檢查法要求進行了方法學驗證試驗，結果表明，可采用中和劑平皿法進行細菌數、霉菌和酵母菌數檢查;可采用中和劑常規法進行控制菌檢查。為此，建議對化妝品類進行微生物限度檢查法驗證試驗。若以每g為單位報告，建議限度標準可規定每g細菌數不得過100CFU，霉菌數不得過100 CFU，不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄114.

[2]馬緒榮，蘇德模.藥品微生物檢驗手冊[M].北京:科學出版社，2003:53－57.

[3]任安民，李秋菲，繩金房.注射劑無菌檢查的方法學驗證試驗[J].西北藥學雜志，2009，24(1):51 －52.

[4]應國紅，鄧 穎，馮豐湊.外用制劑微生物限度檢查方法研究[J].中國藥業，2008，17(21):32 －33.

[5]南京藥學院.藥劑學[M].北京:人民衛生出版社，1978:318，496.