APP695-siRNA慢病毒載體構建及其對SH-SY5Y細胞中APP695基因的沉默作用*

溫麗君，滕軍放#，趙莘瑜，崔月梅，巴慶華，張愛玲

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科鄭州450052 2)鄭州人民醫院神經內科鄭州450003

(2010-10-20收稿 責任編輯 趙秋民)

淀粉樣肽前體蛋白(amyloid protin precursor，APP)基因位于21號染色體長臂，轉錄后mRNA經不同剪接方式編碼得到695～770個氨基酸多肽，其主要形式為APP695、APP751和APP770，其中在人腦中主要是APP695［1］。3種APP都含有β-淀粉樣肽(β-amyloid，Aβ)結構區，但是 APP75l和 APP770含有一個Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制因子的結構域，而APP695則沒有。研究［2］表明，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者腦部基底核和藍斑神經元中APP mRNA升高達2倍，并確認是由于APP695 mRNA的選擇性升高所致。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術已經成為基因功能研究中非常重要的工具，為治療神經系統退行性病變(如AD)提供了重要的手段［3-4］。而慢病毒載體介導的RNAi技術則可以提供長期的基因表達抑制，因此更適合于體內實驗及臨床研究的需要［5］。作者構建了針對APP695的siRNA慢病毒載體，并在人神經纖維母細胞瘤SH-SY5Y細胞中驗證其沉默效率，為APP695的后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 293T細胞、SH-SY5Y細胞、pFUGW-iRNA載體、2種輔助包裝原件載體質粒(pHeper1.0、pHeper2.0)、寡核苷酸序列及引物(上海吉凱基因技術有限公司)，Lipofectamine 2000以及RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)，大腸桿菌菌株DH5α、DMEM(GIBCO公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶(上海化學試劑公司)，限制性內切酶HpaⅠ、XhoⅠ和T4 DNA連接酶(New England Biolabs公司);QIHPA IN Plasmid大抽試劑盒(荷蘭Qiagen公司)，M-MLV逆轉錄試劑盒(Promga公司)，實時熒光定量PCR儀(FQ-RT-PCR，TaKaRa公司)，實驗設備由河南省醫藥科學研究所實驗室提供。

1.2 靶向APP695基因siRNA的設計及合成 根據GenBank中人APP695基因核苷酸序列(NM_A33292.1)，設計針對人APP695基因的siRNA靶序列 5’-CATGCACATGAATGTCCAG-3’，同時設計一段不與人其他cDNA序列同源的陰性對照序列5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。再根據以上序列分別合成2對寡核苷酸序列，每對包含一條正義鏈和一條反義鏈，2對寡核苷酸序列退火產物均在5’端含HpaⅠ酶切殘基，3’端含XhoⅠ酶切殘基。

1.3 APP695-siRNA重組質粒的構建 pFU-GW-iRNA載體用HpaⅠ、XhoⅠ行雙酶切，將酶切產物回收并和上述寡核苷酸退火后的產物混合，然后經T4 DNA連接酶于16℃連接過夜。連接后的重組質粒轉化感受態大腸桿菌菌株DH5α，經含氨芐霉素抗性的LB瓊脂培養基篩選后，挑取菌落并進行陽性克隆PCR鑒定，然后用QIHPA IN Plasmid大抽試劑盒抽提質粒并通過DNA測序進一步鑒定。

1.4 siRNA慢病毒顆粒的包裝生產 293T細胞置于含體積分數為10%胎牛血清的DMEM培養液中，37℃、體積分數為5%CO2培養箱內培養。待細胞密度達 70% ～80%時，按 Invitrogen公司 Lipofectamine 2000說明書將慢病毒重組質粒分別與pHeper1.0、pHeper2.0 共感染293T 細胞，感染后8 h更換完全培養基，培養48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，于4℃ 4 000 r/min離心10 min，取病毒上清液，以0.45μm濾器過濾后即得到重組慢病毒載體pAPP695-siRNA-LV和陰性對照載體pFU-siRNA-NC-LV，凍存于－80℃冰箱中備用。

1.5 細胞培養及感染 按1.3的方法培養 SHSY5Y細胞。感染前24 h接種于24孔板上，每孔接種5×104個細胞。將各孔細胞隨機分為3組:未經病毒感染組(CON組，細胞不經過任何處理，正常生長)，陰性對照病毒感染組(NC組，用 pFU-siRNANC-LV感染細胞)，慢病毒介導陽性干擾組(APP695-siRNA組，用 pAPP695-siRNA-LV感染細胞)。每組均設3個復孔。

1.6 siRNA對 APP695 mRNA干擾效率的 FQRT-PCR檢測 病毒感染72 h后，從24孔板中收集細胞，應用RNA提取試劑盒抽提總RNA，用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，然后用FQ-RT-PCR儀進行PCR擴增。采用Beacon designer 2軟件設計actin和 APP695引物。APP695上游引物序列:5’-CTGATGCGGAGGAGGATGAC-3’，下游引物序列5’-TCTCTGTGGCTTCTTCGTAGG-3’;actin上游引物序列5’-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3’，下游引物序列5’-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3’。PCR 反應條件:95℃預變性15 s，之后每一步95℃變性15 s，60℃退火延伸30 s，共進行45個循環。參考文獻［6］計算各組細胞中APP695 mRNA的相對表達量。

1.7 統計學處理 采用SPSS17.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組細胞中APP695 mRNA相對表達量的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 重組質粒的PCR鑒定 見圖1。結果表明目標片段已正確插入pFU-GW-iRNA質粒載體。

圖1 慢病毒表達載體的PCR鑒定1:陰性對照;2:pFU-siRNA-NC-LV;3:Marker;4～6:pAPP695-siRNA-LV。

2.2 各組病毒感染效率 SH-SY5Y細胞感染病毒72 h后觀察熒光，各組病毒感染效率均在70%左右。

2.3 siRNA對APP695 mRNA的干擾結果 干擾72 h后，APP695-siRNA組APP695 mRNA相對表達量(0.20 ±0.01)低于 CON 組(0.95 ±0.02)和 NC組(1.00 ±0.05)，差異有統計學意義(F=554.442，P＜0.001)，CON組與NC組APP695 mRNA的相對表達量相比差異無統計學意義(P=0.112)。

3 討論

質粒介導RNAi有一定的局限性，感染率低，基因抑制表達作用弱，持續時間短［7］，而慢病毒載體是一種復制缺陷型逆轉錄病毒載體，以HIV-1為基礎發展而得，具有許多優點，該載體不僅能夠提供包裝時所需要的蛋白成分和具有插入目的基因的多克隆位點的載體成分，同時，重組病毒是一類缺陷病毒，離開包裝的細胞后病毒顆粒僅能轉導細胞，但不能自我復制，這就為其安全性提供了更有效的保證［8］。慢病毒載體既能夠感染分裂活躍期的細胞，又能高效率感染分裂緩慢或非分裂期的細胞，并且慢病毒RNAi作用持久，不易誘發宿主免疫反應，因此慢病毒載體是當前基因治療載體研究的工具［9-10］。

作者成功構建了人APP695基因siRNA慢病毒載體，其可有效地沉默SH-SY5Y細胞中APP695基因表達，為進一步進行APP695基因的體內外研究奠定了基礎。

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