腺病毒載體左側(cè)反向末端重復(fù)區(qū)對下游基因表達特異性的影響

徐遠玲，張旭東，馬宏寶#

1)鄭州大學(xué)生物工程系鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科鄭州 450052

#通訊作者，男，1957年4生，博士，教授，研究方向:生物化學(xué)，E-mail:mahongbao@zzu.edu.cn

腺病毒載體左側(cè)反向末端重復(fù)區(qū)對下游基因表達特異性的影響

徐遠玲1)，張旭東2)，馬宏寶1)#

1)鄭州大學(xué)生物工程系鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科鄭州 450052

#通訊作者，男，1957年4生，博士，教授，研究方向:生物化學(xué)，E-mail:mahongbao@zzu.edu.cn

腺病毒;左側(cè)反向末端重復(fù)區(qū);綠色熒光蛋白

目的:研究腺病毒載體左側(cè)反向末端重復(fù)區(qū)(ITR)對下游基因表達特異性的影響。方法:采用分子生物學(xué)方法及Gateway技術(shù)構(gòu)建正反2個方向含有人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子及GFP報告基因的重組腺病毒載體。以含CMV啟動子及GFP報告基因的重組腺病毒載體和不含任何啟動子只含GFP報告基因的重組腺病毒載體作對照。重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ線性化后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293A細胞，包裝并擴增出重組腺病毒顆粒，TCID50測得滴度后分別以相同的感染復(fù)數(shù)感染4種腫瘤細胞，觀察熒光表達情況。結(jié)果:攜帶正向和反向hTERT啟動子的重組腺病毒載體在各細胞中熒光表達量無差異，無啟動子的重組載體在腺病毒增殖比較強的細胞中有微弱熒光表達。結(jié)論:重組腺病毒左側(cè)ITR能夠影響上下游特異啟動子及其調(diào)控基因表達，但對上下游基因的影響程度無明顯差異，并且左側(cè)ITR具有類啟動子功能。

近年來，重組腺病毒載體逐漸成為目前應(yīng)用最廣泛的基因治療載體之一。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)在90%以上腫瘤細胞中的活性是增高的，而在絕大多數(shù)體細胞中無活性，因此hTERT啟動子常作為腫瘤特異性啟動子應(yīng)用于條件復(fù)制型腺病毒來進行基因治療的研究［1］。腺病毒基因組兩端各有一個反向末端重復(fù)區(qū)(inverted terminal repeat，ITR)，是腺病毒復(fù)制必需的順式作用元件。其中左側(cè)ITR含有增強子區(qū)域，對下游基因轉(zhuǎn)錄有著比較顯著的影響［2］。作者構(gòu)建了正反2個方向含hTERT啟動子的腺病毒表達載體，以CMV啟動子和反向不含啟動子的腺病毒表達載體為對照，通過比較各載體熒光表達情況來研究ITR對下游基因表達特異性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 攜帶CMV啟動子和E1a基因的入門載體質(zhì)粒pENTR-CMV-E1a，攜帶GFP和IRES基因片段的質(zhì)粒載體pIRES-GFP，大腸桿菌DH5α、TOP10及人胚腎293A細胞、人鼻咽癌CNE細胞、人骨肉瘤U-2OS細胞、人乳癌435S細胞、人胰腺癌Panc1細胞，均為鄭州大學(xué)特聘教授韓志強實驗室保存。T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、去磷酶、pMDTM-18-T載體均購自寶生物工程有限公司，胎牛血清購于HyClone公司，LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司，各試劑盒均購于美國Axygen公司，PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 pMD-T-hTERT載體構(gòu)建 用基因組DNA小量抽提試劑盒，從293A細胞中提取人基因組DNA。根據(jù)GenBank中hTERT基因序列，設(shè)計引物，序列如下:上游引物5’-TTTGGATCCCGATTCGACCTCTC TCCGCTGGGGC-3’，下游引物5’-TTTCTCGAGCAG GGCTTCCCACGTGCGCAGCAG-3’。以人基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)擴增403 bp的hTERT啟動子基因片段。反應(yīng)條件為:95℃5 min;95℃30 s，65℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒回收目的片段，并用TA克隆方法連接到pMDTM-18-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10，氨芐抗性篩選后提質(zhì)粒，酶切鑒定得到的陽性菌落送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST序列比對后與GenBank中hTERT啟動子序列相吻合，從而獲得含有403 bp的hTERT啟動子基因的pMD-T-hTERT載體。

1.3 攜帶hTERT啟動子的正反2個方向入門載體的構(gòu)建 用HincⅡ和XhoⅠ酶切pMD-T-hTERT，膠回收420 bp的hTERT基因片段。用XmnⅠ和XhoⅠ酶切pENTR-CMV-E1a，膠回收4 737 bp的DNA片段為載體。過夜連接后，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，卡那抗性菌落篩選后酶切鑒定，正確菌落為正向入門載體 pENTR-hTERT-E1a。用 MluⅠ和BamHⅠ酶切pENTR-hTERT-E1a，膠回收2 516 bp含hTERT啟動子和 E1a基因的目的片段。用BamHⅠ和PstⅠ酶切pENTR-hTERT-E1a，膠回收2 146 bp的DNA片段為載體，去磷后與先前回收的含hTERT啟動子和E1a基因的目的片段連接、轉(zhuǎn)化，卡那抗性菌落篩選后酶切鑒定，得到反向入門載體pENTR-rhTERT-E1a。

1.4 攜帶CMV反向入門載體的構(gòu)建 用BamHⅠ和BglⅡ酶切pENTR-CMV-E1a，分別回收3 203 bp含CMV啟動子及E1a基因的目的片段和2 641 bp的載體片段。載體去磷后與目的片段連接、轉(zhuǎn)化，卡那抗性菌落篩選后酶切鑒定，得到反向入門載體pENTR-rCMV-E1a。

1.5 攜帶GFP報告基因的各入門載體的構(gòu)建 用SalⅠ和XhoⅠ酶切pIRES-GFP質(zhì)粒，膠回收1 362 bp含GFP-IRES基因的目的片段。用XhoⅠ分別酶切pENTR-hTERT-E1a、pENTR-rhTERT-E1a、pENTRCMV-E1a、pENTR-rCMV-E1a質(zhì)粒，膠回收線性DNA片段為載體，分別去磷后與含GFP-IRES基因的目的片段連接、轉(zhuǎn)化，卡那抗性菌落篩選后酶切鑒定，得到攜帶GFP的入門載體pENTR-hTERT-GFPIRES-E1a、pENTR-rhTERT-GFP-IRES-E1a、pENTRCMV-GFP-IRES-E1a 和 pENTR-rCMV-GFP-IRESE1a。用 SpeⅠ和 XhoⅠ酶切 pENTR-rCMV-GFPIRES-E1a，膠回收6 267 bp的DNA片段為載體，補平后自連，轉(zhuǎn)化，卡那抗性篩選后酶切鑒定，得到不含啟動子只含GFP的入門載體pENTR-rGFP-IRESE1a。

1.6 腺病毒重組與包裝 將構(gòu)建好的入門載體pENTR-hTERT-GFP-IRES-E1a、pENTR-rhTERT-GFPIRES-E1a、pENTR-CMV-GFP-IRES-E1a、pENTR-rCMV-GFP-IRES-E1a和 pENTR-rGFP-IRES-E1a用Gateway技術(shù)通過LR反應(yīng)與DEST重組，然后轉(zhuǎn)化至TOP10，氨芐抗性菌落篩選后酶切鑒定。分別獲得重組腺病毒質(zhì)粒Adv-hTERT-GFP-IRES-E1a、AdvrhTERT-GFP-IRES-E1a、 Adv-CMV-GFP-IRES-E1a、Adv-rCMV-GFP-IRES-E1a及 Adv-rGFP-IRES-E1a，再用PacⅠ酶分別酶切，使其線性化，暴露ITRs端，在脂質(zhì)體LipofectamineTM2000的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染293A細胞，轉(zhuǎn)染12 d后80%細胞出現(xiàn)細胞病變反應(yīng)時，收集細胞及培養(yǎng)液于無菌離心管中并放置于－80℃冷凍柜中30 min，然后37℃水浴15 min解凍。重復(fù)此步驟2次。0.22 μm過濾后至無菌離心管中保存于－80℃。第1代病毒病毒滴度低，將其重新感染293A細胞，使其大量擴增，獲得高滴度第2代病毒，用 TCID50方法測定滴度并分別命名為hTERT、rhTERT、CMV、rCMV和rGFP。

1.7 重組腺病毒感染腫瘤細胞后的熒光表達情況

取對數(shù)生長期的CNE、435S、Panc1和U-2OS細胞，分別按1×105孔－1加于24孔板，以293A細胞作對照。過夜培養(yǎng)后，按感染復(fù)數(shù)(multiple of infection，MOI)值為1分別加入重組腺病毒hTERT、rhTERT、CMV、rCMV和rGFP。培養(yǎng)2 d后觀察重組腺病毒在各細胞中的熒光表達情況。

2 結(jié)果

2.1 入門載體的鑒定 pENTR-hTERT-E1a質(zhì)粒用SacⅡ和 SacⅠ酶切鑒定，pENTR-rhTERT-E1a和pENTR-rCMV-E1a用EcoRⅤ和XhoⅠ酶切鑒定，pENTR-hTERT-GFP-IRES-E1a、pENTR-rhTERT-GFPIRES-E1a和pENTR-CMV-GFP-IRES-E1a用EcoRⅤ和KpnⅠ酶切鑒定，pENTR-rCMV-GFP-IRES-E1a用HindⅢ酶切鑒定，pENTR-rGFP-IRES-E1a用NdeⅠ和XhoⅠ酶切鑒定。各入門載體的酶切鑒定結(jié)果見圖1，其中泳道1為陽性克隆。

2.2 重組腺病毒包裝、滴度測定及熒光表達 重組腺病毒轉(zhuǎn)染293A細胞12 d后80%細胞出現(xiàn)細胞病變反應(yīng)。5種重組腺病毒的第2代病毒滴度均約為9.4×1012pfu/L。在MOI值和感染時間相同的條件下，在各細胞中，CMV表達的熒光較rCMV略強，hTERT表達的熒光較 rhTERT略強，rGFP在293A及Panc1細胞中表達很微弱的熒光(圖2)。

3 討論

目前，腺病毒載體因其各方面的優(yōu)點逐漸成為基因治療中應(yīng)用最廣泛的一種病毒載體。CMV啟動子是啟動真核基因表達的最強啟動子，并被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建高效真核表達載體，是比較理想的陽性對照。GFP是從水母中分離出來的一種具有自發(fā)熒光的小分子蛋白質(zhì)，具有可視性強、不需要外源底物等優(yōu)點作為報告基因廣泛應(yīng)用于細胞學(xué)的研究［3］。該實驗所構(gòu)建的重組腺病毒載體均以GFP為報告基因，其在293A細胞中的包裝情況很容易通過熒光顯微鏡來觀察，并為病毒滴度測定帶來很大方便，在重組腺病毒感染靶細胞時，也很容易觀察其感染效率。

作者構(gòu)建的以上5種攜帶GFP報告基因的重組腺病毒載體，以相同的MOI分別感染CNE、435S、Panc1、U-2OS及293A細胞，感染相同的時間后，發(fā)現(xiàn)正向和反向攜帶CMV啟動子的重組腺病毒在各細胞中均表達很強的熒光，正向比反向略強。攜帶hTERT啟動子的重組腺病毒在U-2OS細胞無熒光表達(因U-2OS細胞是端粒酶陰性細胞)。而在其他4種細胞中均有熒光表達，正向略強于反向。無啟動子的重組腺病毒載體，只在293A及Panc1細胞中表達非常微弱的熒光。而攜帶啟動子的腺病毒載體在293A及Panc1細胞中表達的熒光亮度比其他3種細胞都較強。以上結(jié)果表明，重組腺病毒左側(cè)ITR對下游基因的表達影響不會因下游基因的方向倒轉(zhuǎn)而消失。并且，左側(cè)ITR也可能有天然啟動子的功能，使得下游基因在沒有啟動子的情況下也能微量表達。目前，已有研究［4］表明，腺病毒ITR有啟動子活性，并且也有研究［5］指出，在牛的3型腺病毒中，左側(cè)ITR包含有E1a的惟一啟動子。該實驗構(gòu)建的無啟動子的載體，報告基因在左側(cè)ITR下游是反向的，其在腺病毒增殖較強的細胞中能表達熒光的現(xiàn)象進一步證明了在左側(cè)ITR區(qū)下游倒轉(zhuǎn)目的基因，并不能使其對下游基因表達的影響消失。

相關(guān)實驗［6］表明在條件復(fù)制型腺病毒表達載體中用hTERT啟動子來控制基因的表達是一種很有前景的腫瘤靶向性基因治療策略。而腺病毒基因組兩端的末端重復(fù)序列ITRs是腺病毒復(fù)制必需的順式作用元件，其左側(cè)ITR是影響外源基因表達的重要原件之一，影響了左側(cè)ITR下游的由hTERT啟動子控治的治療基因的特異性表達，如何避開此類影響成為亟待解決的問題。

總之，該實驗的研究結(jié)果證明，在重組腺病毒左側(cè)ITR下游倒轉(zhuǎn)目的基因的方向并不能很好地避開ITR的影響。

［1］董翠，陰志剛，王純耀，等.人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子調(diào)控的真核熒光表達載體的構(gòu)建與表達［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2010，45(3):448

［2］Li C，Hirsch M，Carter P，et al.A small regulatory element from chromosome 19 enhances liver-specific gene expression［J］.Gene Therapy，2008，16(1):43

［3］Ehrhardt D.GFP technology for live cell imaging［J］.Curr Opin Plant Biol，2003，6(6):622

［4］Yamamoto M，Davydova J，Takayama K，et al.Transcription initiation activity of adenovirus left-end sequence in adenovirus vectors with e1 deleted［J］.J Virol，2003，77(2):1633

［5］Xing L，Tikoo SK.E1A promoter of bovine adenovirus type 3［J］.J Gen Virol，2006，87(12):3539

［6］Jacob D，Davis J，Zhu H，et al.Suppressing orthotopic pancreatic tumor growth with a fiber-modified adenovector expressing the TRAIL gene from the human telomerase reverse transcriptase promoter［J］.Clin Cancer Res，2004，10(10):3535

Influence of the left ITR in recombinant adenovirus vectors on the expression of downstream genes

XU Yuanling1)，ZHANG Xudong2)，MA Hongbao1)1)Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 2)Department of Oncology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

Adenovirus;inverted terminal repeat;green fluorescent protein

Aim:To study the expression of specific gene downstream of the left inverted terminal repeat(ITR)in adenovectors.Methods:Construct a series of recombinant adenovirus vectors that contains green fluoresent protein(GFP)and hTERT promoter and recombinant adenovirus vectors containing the same transgene but in different orientations.The virus control group that contains CMV promoter and the other one which contains non-promotor.The recombinant adenovirus plasmids were digested with PacⅠand transferred into 293A cells mediated by Liopfectamine2000 to package recombinant adenovirus particles and then titrated using 50%tissue culture infective dose(TCID50)assay.All of the virus infected four tumor cell whith the same MOI and the green fluorescence was observed by fluorescent microscopy.Results:By statistical analysis，the fluorescent in each group does not exist significant difference and The faint fluorescent can be observed in the cell in which adenovirus absence of promoter.Conclusion:The enhancer elements of the left ITR in recombinant adenovirus effect the expression of the upstream gene and downstream gene but the influence does not exist significant difference.Studies by this experiment have also demonstrated that the left ITR contains cryptic transcription start sites.

R730.5

(2010-11-01收稿 責(zé)任編輯趙秋民)