ABH1融合蛋白表達載體的構建及表達純化

李紅俊，翟明霞，高艷鋒#

1)鄭州大學生物工程系鄭州 450001 2)北京生命科學研究所北京 102206

#通訊作者，男，1980年10月生，博士，副教授，研究方向:腫瘤免疫與抗腫瘤藥物，E-mail:gaoyf@zzu.edu.cn

ABH1融合蛋白表達載體的構建及表達純化

李紅俊1，2)，翟明霞1)，高艷鋒1)#

1)鄭州大學生物工程系鄭州 450001 2)北京生命科學研究所北京 102206

#通訊作者，男，1980年10月生，博士，副教授，研究方向:腫瘤免疫與抗腫瘤藥物，E-mail:gaoyf@zzu.edu.cn

ABH1;表達純化;核酸結合蛋白

目的:構建ABH1重組蛋白原核表達載體及建立ABH1蛋白純化技術。方法:應用PCR技術從人的cDNA文庫擴增出ABH1基因片段，并加入限制性內切酶位點和終止子，進而將其插入到原核表達質粒pET-15b中，構建ABH1/15b原核表達克隆，最后用IPTG誘導其在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，用鎳柱親和純化，離子交換層析及凝膠過濾層析三步法純化ABH1蛋白，并采用電泳遷移率實驗(EMSA)檢測所純化蛋白的DNA結合活性。結果:PCR鑒定和誘導表達陽性結果表明ABH1基因被成功構建入載體pET-15b中，測序分析顯示，插入片段全長為1 189 bp，插入位點、終止位點及閱讀框都完全正確。經IPTG誘導表達和純化后，從轉入ABH1/15b質粒的BL21菌株中提取并純化了45 000的ABH1融合蛋白，經EMSA檢測ABH1是一個核酸結合蛋白。結論:成功構建了重組ABH1/15b的原核表達載體，最終得到了高純度蛋白，為進一步研究ABH1的功能和活性機制提供了實驗材料。

所有的生物體都擁有多種DNA修復酶來維持它們的遺傳信息的完整性［1］。大腸桿菌的AlkB蛋白在α-酮戊二酸(2-oxoglutarate，2OG)和Fe2+存在的情況下，可以羥化DNA和RNA中的1-甲基腺嘌呤(1-MeA)或3-甲基胞嘧啶(3-MeC)，生成不穩(wěn)定的中間產物，裂解釋放出甲醛，甲基化的堿基恢復成原來的腺嘌呤和胞嘧啶［2］。人體內有8種AlkB的同源蛋白ABH1～ABH8［3］，其中ABH2和ABH3具有與AlkB基本相同的功能，它們具有共同的雙重β-折疊核心結構域，但是核酸結合區(qū)完全不同［4-6］。ABH1比AlkB蛋白長173個氨基酸(N端71個，C端42個，其余的分布在序列內部)［7］。最新的研究［8］發(fā)現ABH1是一個多功能的酶，它具有依賴2OG和Fe2+修復3-MeC的功能，但是活性較弱，且不能修復1-MeA，此外，它還具有一個全新的酶活性——DNA無堿基位點裂解酶活性，而這一功能在所有的DNA修復機制中都有非常重要的作用。因此，作者擬將ABH1基因序列插入到原核表達載體上，構建重組克隆，以表達并純化ABH1融合蛋白，用于ABH1的功能研究，為ABH1晶體學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大腸桿菌BL21(DE3)為北京生命科學研究所柴繼杰實驗室保存，pET-15b表達載體購自Invitrogen公司，人cDNA、LA-Taq、高保真DNA聚合酶PFU購自TaKaRa公司，DNA限制性內切酶購自NEB公司，T4 DNA連接酶購自Promega公司，DNA膠回收試劑盒購自中科瑞泰公司，質粒小提試劑盒購自NCR生物公司。親和層析介質Ni-NTA His-Bind Resin購自Novagen公司，肝素親和柱HiTrapTMHeparin HP、離子交換柱Source Q HR15/5和凝膠過濾層析預裝柱Superdex 200購自Pharmacia公司。

1.2 引物設計與合成 根據ABH1在GenBank中NM_006020.2基因序列，設計一對引物，擴增1 189 bp完整的閱讀框，下劃線部分為NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。P1:5’-GGAATTCATATGGGGAAGATG GCAGCGGCC-3’;P2:5’-GGAATTCTCGAGTCAGCT GTCAGGGTTTAT-3’。

1.3 目的基因的PCR擴增及產物的純化 首先以人的cDNA為模板，用PCR方法擴增得到ABH1的基因片段。PCR反應體系:10×反應緩沖液2 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)0.8 μL，上、下游引物各25 μmol/L，模板0.5 μL，DNA聚合酶0.75 U，補水至20 μL。PCR反應條件:95℃4 min;94℃1 min，52℃30 s，72℃2 min，30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，DNA膠回收試劑盒進行純化，操作方法按產品說明書進行。

1.4 ABH1/15b克隆載體的構建及鑒定 回收目的基因片段后，用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切產物，將酶切產物與載體pET-15b連接，轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞。采用雙篩選法鑒定ABH1/15b陽性克隆，吸取各個單克隆對應的菌液1 μL作為PCR鑒定的模板進行菌液PCR鑒定。同時于各管菌液中加入1 μL 0.6 mol/L的IPTG后，在37℃ 200 r/min振蕩環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)并進行目的蛋白的誘導表達，SDS-PAGE電泳鑒定。選取并保存雙陽性結果的ABH1/15b單克隆，并對陽性結果進行測序，確保基因序列的完全正確。1.5 ABH1蛋白的提取和純化 將攜帶有表達ABH1/15b載體的BL21(DE3)在LB培養(yǎng)基中37℃220 r/min培養(yǎng);當A(600 nm)為0.8時，將搖床溫度調低至15℃;當培養(yǎng)基溫度平衡至15℃時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;收集菌體，加入終濃度為1 mmol/L的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF);在冰水浴中用超聲波破碎，至菌懸液澄清;16 000 r/min高速離心50 min，取上清。按照三步法純化ABH1蛋白:第一步，鎳柱親和純化，洗脫緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑)洗脫體積為60 mL。第二步，離子交換純化，利用快速液相色譜，過陰離子交換層析柱，選取峰尖蛋白，利用30 000濃縮管濃縮至約2 mL。第三步，凝膠過濾層析純化，換用凝膠過濾層析柱，對上一步得到的2 mL蛋白進行最終純化。

1.6 蛋白功能檢測 采用電泳遷移率實驗(electrophoretic mobilty shift assay，EMSA)檢測其與質粒DNA和PCR片段的結合活性。首先將20 μL 0.1 mmol/L的質粒DNA和PCR片段與0.15 mmol/L的ABH1等體積充分混勻，冰上放置15 min，然后10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測蛋白與核酸的相互作用。再采用肝素親和柱純化該蛋白。

2 結果

2.1 雙篩選法鑒定ABH1/15b陽性克隆 挑選4個單克隆，菌液PCR鑒定結果均為陽性，產物大小為1 189 bp(圖1)。誘導表達鑒定顯示表達明顯且表達量較多，大小約45 000，與其理論相對分子質量43 800接近(圖2)。同時，對陽性菌株提取質粒進行測序，測序結果完全正確。ABH1/15b克隆構建成功。

2.2 表達純化結果 鎳柱親和層析純化后，蛋白純度較低;過陰離子交換層析柱后，獲得了很好的純化效果，出峰時的電導為10 mS/cm，峰形比較理想(圖3)。凝膠過濾層析柱純化的蛋白出峰位置在C7、 C8，所純化的ABH1應該以非聚合形式存在(圖4)。

2.3 蛋白功能檢測結果 EMSA實驗結果顯示，ABH1與質粒DNA相互作用明顯，與蛋白結合的質粒DNA和PCR產物在凝膠電泳中遷移速度明顯變慢(圖5)。肝素親和純化實驗結果顯示，ABH1與肝素親和柱具有較強的親和能力，需要約30 mS/cm的電導才可以洗脫下來(圖6)。

3 討論

目前，研究蛋白質功能的最佳材料是從天然來源中分離。然而，大多數蛋白質在天然來源中含量很低，從中純化出大量可用于研究的量非常困難。現代分子生物學技術提供了非常實用的工具，使大量表達純化重組蛋白成為現實。利用這些方法大量表達并純化的ABH1蛋白具有高純度、高均一性，可以用于酶動力學和晶體結構的研究［9-10］。

ABH1在體內主要分布在心臟和骨骼肌組織，這些組織均富含線粒體，預測ABH1可能是一個線粒體核酸甲基化修復酶，與線粒體功能紊亂和衰老有緊密的聯系。線粒體DNA損傷及修復方面的研究［11］受到國內外科學家的高度關注。另有研究［12］表明，ABH1在體內與Mrj具有很強的相互作用，Mrj是一個在胎盤表達的蛋白，它通過對組蛋白的去乙酰化調節(jié)基因表達，這也提示ABH1可能在基因調控中發(fā)揮作用。

根據目前的研究現狀，在所有哺乳動物的AlkB同源蛋白中，ABH1是第一個被發(fā)現同時具有DNA/ RNA甲基化修復活性和DNA無堿基位點裂解酶活性的蛋白［13］。ABH1全長有389個氨基酸。結構預測顯示片段115～300氨基酸為依賴2OG和Fe2+的去甲基化酶活性結構域，可能與去甲基活性有關;蛋白序列比對顯示N端1～72氨基酸與其他的哺乳動物AlkB同源物沒有明顯的同源性，它可能與無堿基裂解酶活性相關［14］。該實驗也表明體外表達純化的ABH1可以與DNA結合。作者下一步將嘗試ABH1蛋白單獨及與DNA復合的晶體學研究。

［1］Wood RD，Mitchell M，Sgouros J，et al.Human DNA repair genes［J］.Science，2001，291(5507):1284

［2］Falnes Pφ，Johansen RF，Seeberg E.AlkB-mediated oxidative demethylation reverses DNA damage in Escherichia coli［J］.Nature，2002，419(6903):178

［3］Drablφs F，Feyzi E，Aas PA，et al.Alkylation damage in DNA and RNA-repair mechanisms and medical significance［J］.DNA Repair，2004，3(11):1389

［4］Yu B，Edstrom WC，Benach J，et al.Crystal structures of catalytic complexes of the oxidative DNA/RNA repair enzyme AlkB［J］.Nature，2006，439(7078):879

［5］Yang CG，Yi C，Duguid EM，et al.Crystal structures of DNA/RNA repair enzymes AlkB and ABH2 bound to dsDNA［J］.Nature，2008，452(7190):961

［6］Sundheim O，Vagbo CB，Bjoras M，et al.Human ABH3 structure and key residues for oxidative demethylation to reverse DNA/RNA damage［J］.EMBO J，2006，25(4):3389

［7］Falnes Pφ.Repair of 3-methylthymine and 1-methylguanine lesions by bacterial and human AlkB proteins［J］.Nucleic Acids Res，2004，32(21):6260

［8］Müller TA，Meek K，Hausinger RP.Human AlkB homologue 1(ABH1)exhibits DNA lyase activity at abasic sites［J］.DNA Repair，2010，9(1):58

［9］趙玉霞，楊國俊，章涵，等.幽門螺桿菌UreB-Omp11融合蛋白的表達、純化與免疫學活性檢測［J］.鄭州大學學報:醫(yī)學版，2009，44(1):125

［10］王會巖，田海山，趙宏鑫，等.人成纖維細胞生長因子-21基因的克隆表達及蛋白的純化［J］.吉林大學學報:醫(yī)學版，2010，36(1):81

［11］Westbye MP，Feyzi E，Aas PA，et al.Human AlkB homolog 1 is a mitochondrial protein that demethylates 3-methylcytosine in DNA and RNA［J］.J Biol Chem，2008，283(36):25046

［12］Pan Z，Sikandar S，Witherspoon M，et al.Impaired placental trophoblast lineage differentiation in Alkbh1 (－/－)mice［J］.Dev Dyn，2008，237(2):316

［13］Law JA，Jacobsen SE.Establishing，maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals［J］.Nat Rev Genet，2010，11(3):204

［14］Wu SC，Zhang Y.Active DNA demethylation:many roads lead to Rome［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2010，11(9):607

Cloning and expression of ABH1 and purification of recombinant protein

LI Hongjun1，2)，ZHAI Mingxia1)，GAO Yanfeng1)1)Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 2)National Institute of Biological Sciences，Beijing 102206

ABH1;expression and purification;DNA-binding protein

Aim:To construct prokaryotic expression system for expressing ABH1 and establishing purification technology of it.Methods:With human cDNA as template，ABH1 gene fragments were obtained by PCR.The ABH1 cDNA fragment was inserted into the multi-cloning site of pET-15b to construct ABH1/15b.ABH1/15b expression in E.coli BL21 (DE3)was induced by IPTG and the fusion protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography，iron exchange chromatography and gel filtration chromatography，and DNA binding activity was tested by electrophoretic mobility shift assay (EMSA).Results:PCR screen and test expression confirmed that the cDNA sequence of ABH1 had been correctly inserted into the multi-cloning site of pET-15b.DNA sequencing showed that in the prokaryotic expression cassette，the inserted sequence，inserted site，stop codon and reading frame of ABH1 were all correct.ABH1(45 000)was successfully extracted and purified from E.coli BL21 after IPTG induction，and the result of EMSA showed that ABH1 was a DNA-binding protein.Conclusion:Prokaryotic expression vector for expression of ABH1 was successfully constructed.The target protein of high purity was obtained.It provided the materials for further investigation of the function and mechanism of ABH1.

Q78

(2010-11-15收稿 責任編輯姜春霞)