河南漢族精神分裂癥患者線粒體DNA 7445和5178位點突變分析*

曹玉媛，張景亮，徐朝陽，程曉麗#

1)鄭州大學基礎醫學院細胞生物學與醫學遺傳學教研室鄭州450001 2)鄭州市精神防治醫院精神科鄭州450005

(2010-12-24收稿 責任編輯 趙秋民)

精神分裂癥(schizophrenia，SZ)是一種嚴重的全球性常見精神疾病，臨床表現為思維、情感、行為等多方面的障礙及精神活動不協調，個體終生患病率約為1.0%。SZ是一種多基因病，其遺傳度達80.0%，發病機制有神經遞質紊亂論、神經發育障礙論和免疫論等［1］。新近 Doi等［2］和 Lauritzen 等［3］從不同的角度分別證實了線粒體在該病中的作用，且Jou等［4］認為應該把精神疾病當作一種代謝病，建議以提升能量代謝、減少氧化應激傷害為治療手段，至此，線粒體致病理論開始廣受關注，線粒體基因突變與精神類疾病發生、發展關系的研究也成為病因學研究的新熱點。線粒體 DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)7445、5178 等位點與SZ發生關系的研究尚未見報道，作者以此為切入點進行研究，評價其在SZ發生中的作用，為SZ的診斷、治療及預防提供分子生物學依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇河南漢族健康無關個體305例(對照組)，男162例，女143例，年齡19～55歲;296例散發SZ病例(患者組)，男158例，女138例，年齡18～54歲，根據《美國精神障礙診斷統計手冊》第3版修訂本(DSM-Ⅲ-R)標準確診為SZ患者，排除伴有嚴重軀體疾病和腦器質性障礙的患者。患者或其監護人及健康人均對該研究知情同意。

1.2 mtDNA 7445和5178位點突變分析 抽取研究對象外周靜脈血3～5 mL，EDTA抗凝，無菌管－20℃保存。采用標準酚/氯仿法抽提總DNA，752型分光光度計對DNA含量及純度進行測定。mtDNA 7445和5178位點引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成。mtDNA 7445上游引物序列:5’-CTTCCCACAACACTTTCTCGG-3’，下游引 物 序 列:5’-GTAAAGGATGCGTAGGGATG-3’;mtDNA 5178上游引物序列 5’-CTTAGCATACTCCT CAATACCC-3’，5’-CTGAATTCTTCGATAATGGCC CA-3’。PCR反應體系為25μL;PCR反應條件:95℃預變性4 min;94℃變性30 s，退火溫度mtDNA 7445 59.9 ℃，mtDNA 5178 58.4 ℃ 30 s，72 ℃ 延伸30 s，共25個循環;最后72℃延伸5 min。PCR結束后，對擴增產物進行限制性片段長度多態性分析。另取PCR擴增產物，用限制性內切酶XbaⅠ(Fermentas公司，酶切 mtDNA 7445)和 AluⅠ(Fermentas公司，酶切mtDNA 5178)分別對PCR產物進行消化，37℃4 h 15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，mtDNA 7445酶切后野生型mtDNA片段長度為400和262 bp，突變型為662 bp;mtDNA 5178酶切后野生型mtDNA片段長度358 bp，突變型為307和512 bp。

1.3 DNA序列測定 采用隨機數字表選取正常和突變個體各3例的PCR產物，由中美泰和生物技術公司進行純化測序。用Chromas讀取測序結果，Clustal X軟件進行多重序列完全比對，以mtDNA劍橋標準序列為參照。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0進行分析，應用χ2檢驗分析2位點突變發生率的差異，檢驗水準α =0.05。

2 結果

mtDNA 7445和5178位點的突變分析見圖1、2。2組中未見mtDNA 7445突變型存在;對照組中檢測出mtDNA 5178 C→A突變69例，SZ患者中檢測出 88例，2組比較差異有統計學意義(χ2=3.931，P=0.047)。測序結果見圖 3，3 例 mtDNA 7445樣本測序結果均見正常XbaⅠ酶酶切識別序列，無突變存在。

3 討論

mtDNA突變能導致多種遺傳性疾病，累及高能耗的大腦、神經、肌肉等不同組織器官，且同一突變可引發多種不同疾病，同一疾病又可由多種不同突變誘導。Chen等［5］研究發現mtDNA 7445位點可發生A→C或A→T突變。mtDNA 7445位點位于線粒體tRNAser(UCN)基因3’末端，是RNAseP剪切識別點，突變將影響基因的正常轉錄、轉錄后修飾等，最終影響線粒體自身多種蛋白質合成，導致細胞氧化磷酸化功能受損及ATP合成不足等。作者對296例SZ患者mtDNA 7445位點檢測未發現有突變存在，因此認為其可能與SZ的發生無關，此結果有待于進一步擴大樣本量進行研究證實。

近來mtDNA 5178基因突變與各種疾病發生、發展關系的研究成為一個新的熱點，已發現mtDNA 5178位點可能與人類血脂、血壓及糖尿病等有一定關系［6］。Washizuka 等［7］對日本雙向情感障礙患者的研究認為此位點突變是風險因子。mtDNA 5178位點位于ND2基因上，ND2基因為線粒體電子呼吸鏈上復合體Ⅰ的編碼基因之一［8］。突變型(mtDNA 5178 A)可導致位于線粒體膜上NADH脫氫酶的第237位氨基酸位點發生亮氨酸到蛋氨酸的轉變。兩氨基酸含有不同的側鏈集團，前者具有脂肪族側鏈，后者則含甲硫集團。突變可影響NADH脫氫酶的生化特性，進一步影響糖代謝及氧化應激水平。Kato等［9］研究發現mtDNA 5178 C→A與人格發育有關。該研究發現突變mtDNA 5178 A基因在SZ患者中占29.7%，而在對照組中占22.6%，兩者相比差異有統計學意義，提示mtDNA 5178A可能是SZ的風險因素。

［1］張景亮，程曉麗，劉淑蓮，等.線粒體 DNA3243、3316、3394位點、突變與精神分裂癥相關分析［J］.第二軍醫大學學報，2011，32(2):179

［2］ Doi N，Hoshi Y，Itokawa M，et al.Persistence criteria for susceptibility genes for schizophrenia:a discussion from an evolutionary viewpoint［J］.PLoSOne，2009，4(11):e7799

［3］ Lauritzen KH，Moldestad O，Eide L，et al.Mitochondrial DNA toxicity in forebrain neurons causes apoptosis，neurodegeneration，and impaired behavior［J］.Mol Cell Biol，2010，30(6):1357

［4］ Jou SH，Chiu NY，Liu CS.Mitochondrial dysfunction and psychiatric disorders［J］.Chang Gung Med J，2009，32(4):370

［5］ Chen J，Yuan H，Lu J，et al.Mutations at position 7445 in the precursor of mitochondrial tRNA(Ser(UCN))gene in three maternal Chinese pedigrees with sensorineural hearing loss［J］.Mitochondrion，2008，8(4):285

［6］Lal S，Madhavan M，Heng CK.The association of mitochondrial DNA 5178 C＞a polymorphism with plasma lipid levels among three ethnic groups［J］.Ann Hum Genet，2005，69(Pt 6):639

［7］ Washizuka S，Ikeda A，Kato N，et al.Possible relationship between mitochondrial DNA polymorphisms and lithium response in bipolar disorder［J］.Int J Neuropsychopharmacol，2003，6(4):421

［8］吳俊涵，劉書蓮，程曉麗，等.河南漢族精神分裂癥患者mtDNA5351位點突變與GRIK2基因兩位點多態性檢測［J］.鄭州大學學報:醫學版，2011，46(1):71

［9］ Kato C，Umekage T，Tochigi M，et al.Mitochondrial DNA polymorphisms and extraversion［J］.Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2004，128B(1):76