硫化氫延遲預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷后細胞的保護作用*

李雙鳳，冉 珂，王亞平，唐正國，肖艷英，王 丹

1)中南大學湘雅二醫院麻醉科長沙410011 2)長沙市第三醫院麻醉科 長沙410011

(2010-08-06收稿 責任編輯 趙秋民)

硫化氫(H2S)作為第三種氣體信號分子，近來在心血管系統中的價值備受關注，研究［1］發現H2S可減輕細胞內鈣超載，并能激活細胞信號通路［2］，發揮心肌保護作用。H2S是至今發現惟一的內源性血管平滑肌細胞線粒體敏感性鉀通道(mitochondrial ATP sensitive potassium channel，mitoKATP)開 放劑［3］。作者探討H2S預處理的延遲相對大鼠心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷的改善作用及mitoKATP對此作用的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 硫氫化鈉和mitoKATP阻滯劑5-羥葵酸(5-HD)均購自美國Sigama公司，Bcl-2、Bax大鼠單抗IgG和辣根酶標記山羊抗大鼠IgG購自Santa Cruz公司，GAPDH大鼠單抗IgG購自美國ProMab公司。

1.2 動物分組 健康成年雄性SD大鼠(32只，體質量300～320 g)由湖南斯萊景達實驗動物有限公司提供，采用隨機數字表將大鼠分為4組，每組8只。假手術組(Sham組):行冠脈穿線但不結扎;心肌缺血再灌注組(IR組):開胸結扎左冠前降支(LAD)30 min，松解后再灌注2 h;H2S預處理組(H2S組):靜脈注射硫氫化鈉50μg/kg，24 h后同IR組處理;5-HD+H2S組(5-HD組):缺血前15 min靜脈注射5-HD(5 mg/kg)，其他同H2S組處理。

1.3 IR模型的建立［4-5］大鼠經腹腔推注30 g/L戊巴比妥鈉麻醉(30 mg/kg)，多導聯心電監測。氣管插管，動物呼吸機控制呼吸，潮氣量8～10 mL/kg，頻率70 min－1。在心尖搏動最明顯處之上一肋間隙開胸，切開心包，確認左冠圓錐支，在圓錐支之后用7號絲線結扎LAD，立即可見左室前壁紫紺充血，心率減慢，血壓一過性下降，心電圖監測ST段明顯抬高，確認阻斷成功。

1.4 各組大鼠心肌細胞超微結構的觀察 在再灌注末通過頸靜脈注射氯化鉀0.1 g處死大鼠，每組取2只大鼠，剪取心臟，在冠脈結扎處下0.5 cm處剪取約1 mm3左心室組織，體積分數為2.5%戊二醛固定2 h后，送湘雅醫學院超微病理室，經清洗、固定、梯度脫水、包埋后，在80℃恒溫箱內放置10 h聚合，修組織塊，做超薄切片，用醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙重染色各10 min，用荷蘭FEITecnaiG212型透射電鏡觀察心肌超微結構，并拍片。

1.5 各組大鼠心肌Bcl-2及Bax蛋白的檢測 參考文獻［6］提取心肌蛋白。以GAPDH作為內參，進行蛋白半定量分析:取50μg蛋白質樣品，加膜再生液煮沸變性后，進行120 g/L SDSPAGE電泳;再電轉移至NC膜;用含5 g/L脫脂奶粉的PBS(pH 8.0)封閉2 h;分別加入適量Bcl-2或Bax大鼠單抗IgG(按1∶500稀釋)或大鼠GAPDH單抗IgG(按1∶8 000稀釋)，搖床上室溫反應2 h;洗膜3次，20 min/次;加辣根酶標記山羊抗大鼠 IgG(按1∶50 000稀釋)，室溫反應2 h;洗膜后進行ECL化學發光，X片曝光顯影;用Gel pro 4.0凝膠光密度分析軟件進行分析，測其積分光密度(integrating optical density，IOD)值。

1.6 統計學處理 采用SPSS 13.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組大鼠心肌細胞Bcl-2及Bax蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 H2S預處理對IR損傷大鼠心肌細胞超微結構的影響 Sham組心肌細胞超微結構正常。IR組心肌肌原纖維排列紊亂、大面積斷裂、融合、消失，肌節結構不清;線粒體形態異常，排列紊亂，腫脹，消失成空泡。H2S組心肌肌原纖維排列較整齊，肌節長短較一致，明帶、暗帶仍可見;線粒體輕度腫脹，膜較完整，少量融合形成空泡。與IR組相比，線粒體損傷程度明顯減輕。5-HD組與IR組差異不大(圖1)。

圖1 各組大鼠心肌細胞超微結構(—:2μm)A:Sham組;B:IR組;C:H2 S組;D:5-HD組。①:線粒體;②:肌原纖維;③:空泡。

2.2 H2S預處理對IR損傷大鼠心肌組織Bcl-2及Bax蛋白表達的影響 見圖2、表1。

圖2 H 2 S預處理對IR損傷大鼠心肌組織Bcl-2及Bax蛋白表達的影響

表1 H 2 S預處理對IR損傷大鼠心肌組織Bcl-2及Bax蛋白表達的影響

3 討論

H2S在體內可能存在2種形式，在pH值為7.4的生理條件下，以H2S和HS－2種形式形成一種動態平衡，保證H2S在體內的穩定，維持內環境pH值穩定［7-8］。硫氫化鈉溶液與內源性H2S的體內存在方式相似，而且硫氫化鈉的濃度便于精確定量H2S含量，因此，硫氫化鈉溶液是較理想的外源性H2S供體。Elrod等［9］在大鼠IR時用10～500μg/kg的硫氫化鈉注入左心室進行研究，發現H2S呈劑量依賴性地保護左室功能，減少心肌梗死面積和炎癥反應，減少線粒體損傷;而且發現50μg/kg硫氫化鈉為改善心肌IR損傷的最佳劑量。Pan等［10］通過比較硫氫化鈉延遲預處理與后處理2種方案，發現在心肌梗死前1 d給予單劑量硫氫化鈉比梗死后連續3 d給予能更好地保護心肌。因此，該實驗采用劑量為50μg/kg的硫氫化鈉在缺血前24 h進行延遲預處理方案。

Bcl-2家族分為抑凋亡基因(包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w 等)及促凋亡基因(包括 Bax、Bad、Bcl-xs等)。Hochhauser等［11］用轉基因鼠實驗證實Bax高表達可促進心肌細胞凋亡，且其表達的程度與心肌凋亡的程度呈正相關。Bcl-2和Bax以同源或異源二聚體形式發揮作用，當Bax高表達時，形成同源二聚體Bax/Bcl-2促進凋亡;Bcl-2高表達時，形成異源二聚體Bcl-2/Bax抑制凋亡發生。該研究結果表明硫氫化鈉作為H2S供體能夠降低心肌組織Bax的表達，提高Bcl-2表達，從而產生抗凋亡作用。IR引起心肌凋亡是導致移植心臟功能喪失的重要病理生理學基礎［12］。IR可引起大量自由基的產生，導致線粒體膜通透功能的改變，進而引起線粒體途徑的凋亡。

作者的研究結果表明，給予5-HD后，H2S預處理減輕大鼠心肌IR損傷的效應被取消，而且導致心肌組織中Bcl-2表達下調和Bax表達上調，提示激活mitoKATP后導致Bcl-2上調和Bax表達下調參與了H2S延遲預處理減輕大鼠心肌IR損傷的效應。

通過電鏡觀察，IR預處理可減輕大鼠心肌細胞線粒體損傷程度，給予5-HD后，線粒體形態異常，排列紊亂，腫脹，消失成空泡，與IR組線粒體損傷程度相當。這間接說明激活mitoKATP參與了H2S的心肌線粒體保護功能。

總之，該實驗表明H2S延遲預處理能夠減輕大鼠心臟IR損傷，這種改善作用可能與減少細胞凋亡及激活mitoKATP有關。但細胞損傷可能還存在不依賴mitoKATP的其他途徑，因此，H2S對心肌保護作用的機制還有待進一步研究。

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［4］汪寶軍，付潤芳，岳云霄，等.巴戟天寡糖對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響［J］.鄭州大學學報:醫學版，2010，45(5):792

［5］劉仰斌，李啟華，劉欣.苦菜總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用［J］.鄭州大學學報:醫學版，2010，45(1):107

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［11］Hochhauser E，Kivity S，Offen D，et al.Bax ablation protects against myocardial ischemia-reperfusion injury in transgeic mice［J］.Am J Physiol Heart Cire Physiol，2003，284(6):H2351

［12］Wang N，Minatoguchi S，Chen X，et al.Antidiabetic drug miglitol inhibits myocardial apoptosis involving decreased hydroxyl radical production and Bax expression in an ischaemia/reperfusion rabbit heart［J］.Br J Pharmacol，2004，142(6):983