中國(guó)獼猴CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞對(duì)Vγ2Vδ2 T細(xì)胞體外增殖的影響*

龔光明，秦 潔，軒小燕，杜 英，朱 沙，孫石磊，許予明

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科鄭州450052

(2010-11-06收稿 責(zé)任編輯 王 曼)

自然發(fā)生的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+regulatory T cells，Tregs)通過抑制或影響CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞等的激活、擴(kuò)增和(或)功能，在維持外周耐受和免疫系統(tǒng)平衡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。最近研究［1］表明，γδT細(xì)胞也是Tregs直接調(diào)節(jié)的對(duì)象，Tregs對(duì) γδT細(xì)胞有負(fù)調(diào)節(jié)作用［2-3］。γδT細(xì)胞只占T細(xì)胞總數(shù)的1% ～10%，其抗原識(shí)別受體(T cell receptor，TCR)由γ鏈和δ鏈組成，功能極為復(fù)雜并具有極強(qiáng)的可塑性。聯(lián)合應(yīng)用磷酸化抗原與IL-2可誘導(dǎo)靈長(zhǎng)類動(dòng)物Vγ2Vδ2 T細(xì)胞大量特異性擴(kuò)增，這些擴(kuò)增的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，并能特異性下調(diào)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量［4］。因此，將 Vγ2Vδ2 T細(xì)胞作為感染性疾病潛在的免疫治療工具或靶點(diǎn)，對(duì)難治性尤其是耐藥患者進(jìn)行免疫治療，具有極大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。靈長(zhǎng)類非人動(dòng)物因?yàn)榫哂泻腿祟惙浅＝咏纳飳W(xué)特征，成為研究人類感染性疾病的珍貴動(dòng)物模型［4-5］。作者觀察了中國(guó)獼猴的 Tregs對(duì) Vγ2Vδ2 T細(xì)胞體外增殖的調(diào)節(jié)作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 9只雄性中國(guó)獼猴(Rhesus macaques，RH)由美國(guó)芝加哥伊利諾伊州立大學(xué)生物資源中心提供。其中3只是無潛伏感染的正常動(dòng)物，另6只3個(gè)月內(nèi)人工感染過卡介苗(BCG)。年齡3～6歲，體質(zhì)量3.1～6.9 kg。動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)方法均經(jīng)該校動(dòng)物關(guān)懷與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 抗體和試劑 ①純化鼠抗人CD28(CD28.2)、CD3(SP34)以及PE-Cy7和PB融合的CD3抗體(SP34-2)為BD Pharmingen公司產(chǎn)品，PB融合的鼠抗人CD4(OKT-4)、PE-Cy7融合的CD8(RPA-T8)、PE融合的CD25抗體(BC96)為eBioscience公司產(chǎn)品，純化或FITC融合的TCR Vγ2抗體(7A5)、純化或 FITC融合的TCR Vδ2抗體(15D)購(gòu)自Endogen公司，APC/PE融合的山羊抗鼠 IgG單抗購(gòu)自Biolegend公司。②CFSE細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒(C34554)購(gòu)自Invitrogen/Molecular Probes公司，靈長(zhǎng)類非人動(dòng)物Tregs分離試劑盒(130-092-984)、Anti-mouse IgG磁珠、MACS MultiStand(130-042-303)、LD(130-042-901)和 MS(130-042-201)分離柱、MiniMACS(130-042-102)和MidiMACS(130-042-302)分離單位均為Miltenyi Biotec產(chǎn)品。重組人 IL-2(I7908)、PKH26紅熒光細(xì)胞著色盒(MINI 26)為Sigma/Aldrich產(chǎn)品。③磷酸化抗原 HMBPP［(E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl diphosphate-HMBPP］由德國(guó) Reichenberg Armin實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的獲取及純化 ①外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs):采用密度梯度離心法從15 mL EDTA抗凝的中國(guó)獼猴外周血液中分離PBMCs。②Tregs:從PBMCs中陰性分選 CD4+T細(xì)胞，再?gòu)腃D4+T細(xì)胞中分選CD4+CD25+T細(xì)胞。每次分選的CD4+CD25+T細(xì)胞的純度總是＞90%。具體分選方法參見試劑說明書。

1.3 Tregs對(duì)Vγ2Vδ2 T細(xì)胞增殖的影響 分離6只感染過BCG的中國(guó)獼猴的PBMCs，去除Tregs后以CFSE標(biāo)記，以2×105/孔接種96孔板，分4組，分別加入1∶8、1∶4、1∶2和1∶1比例的 PKH26標(biāo)記的Tregs;分別將HMBPP(終濃度150 nmol/L)、鼠抗人CD3和CD28單抗(終濃度5 mg/L，第0天加入)、IL-2(終濃度20 U/mL)加入相應(yīng)孔中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度下，以含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清、50 U/mL青霉素和50 mg/L鏈霉素的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)7 d后，收集細(xì)胞進(jìn)行CD3、Vδ2熒光抗體染色，24 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀(美國(guó) DakoCytomation公司)檢測(cè)。用Summit V4.3(美國(guó) DakoCytomation公司)分析CD4+T細(xì)胞的CFSE信號(hào)強(qiáng)度。分析時(shí)根據(jù)SSC/FSC和FSC/Pulse Width點(diǎn)陣對(duì)PBL設(shè)門，并排除掉PKH26+細(xì)胞的干擾。細(xì)胞擴(kuò)增比例以CFSEdim細(xì)胞所占CFSE+細(xì)胞的百分比計(jì)算。

1.4 Tregs對(duì)IL-2聯(lián)合 HMBPP 預(yù)激活的 Vγ2δ2 T細(xì)胞增殖的影響 分離3只正常中國(guó)獼猴的PBMCs，去除Tregs后以CFSE標(biāo)記，以4×105/孔接種96孔板，每孔加入HMBPP(終濃度為150 nmol/L)和IL-2(終濃度20 U/mL)于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，第3天半量換液1次并維持IL-2終濃度為20 U/mL。培養(yǎng)5 d后，收集細(xì)胞并標(biāo)記CFSE，與當(dāng)天新鮮分離的同一動(dòng)物的Tregs混合，加入IL-2繼續(xù)培養(yǎng)4 d。實(shí)驗(yàn)第9天收集細(xì)胞，進(jìn)行CD3、CD4及 Vδ2熒光抗體染色，24 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)(同1.3)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad軟件，應(yīng)用t’檢驗(yàn)分析Tregs對(duì)HMBPP及CD3/CD28抗體誘導(dǎo)的Vγ2Vδ2 T細(xì)胞增殖的影響，應(yīng)用單因素方差分析比較Tregs對(duì)IL-2聯(lián)合 HMBPP誘導(dǎo)的 Vγ2Vδ2 T細(xì)胞增殖的影響，應(yīng)用析因設(shè)計(jì)的方差分析比較Tregs對(duì)IL-2聯(lián)合HMBPP預(yù)激活的Vγ2Vδ2細(xì)胞增殖的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 Tregs對(duì) Vγ2Vδ2 T細(xì)胞增殖的影響 見表1、2。Tregs不僅抑制 Vγ2Vδ2 T 細(xì)胞的 HMBPP 抗原特異性擴(kuò)增以及CD3/CD28抗體誘導(dǎo)的抗原非特異性擴(kuò)增，還劑量依賴性抑制IL-2聯(lián)合HMBPP激活的Vγ2Vδ2 T細(xì)胞的擴(kuò)增。

表1 Tregs對(duì)HMBPP及CD3/CD28抗體誘導(dǎo)的 Vγ2Vδ2 T細(xì)胞增殖的影響

表2 Tregs對(duì)IL-2聯(lián)合HMBPP誘導(dǎo)的Vγ2Vδ2 T細(xì)胞增殖的影響 %

2.2 Tregs對(duì) IL-2聯(lián)合 HMBPP預(yù)激活的Vγ2Vδ2 T細(xì)胞增殖的影響 見表3。由表3可知，Tregs對(duì)IL-2聯(lián)合HMBPP預(yù)先激活的Vγ2Vδ2 T細(xì)胞的繼續(xù)擴(kuò)增有抑制作用。

表3 Tregs對(duì)IL-2聯(lián)合HMBPP預(yù)激活的Vγ2Vδ2 T細(xì)胞增殖的影響(n=3) %

3 討論

已有較多的證據(jù)表明可利用Tregs作為免疫治療的工具治療腫瘤［6］、移植［7］和自身免疫病［8］，但其在病原性疾病中的應(yīng)用較少。大量研究［9-12］證實(shí)Tregs可控制多種病原的進(jìn)展，比如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、結(jié)核分枝桿菌及真菌等。IL-17是招募中性粒細(xì)胞移行到肺部的主要細(xì)胞因子。研究［13］表明，在肺結(jié)核感染的早期，作為IL-17的主要產(chǎn)生細(xì)胞，γδT細(xì)胞參與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，包括隨后肉芽腫的形成。

該研究結(jié)果顯示，中國(guó)獼猴Tregs對(duì)Vγ2Vδ2 T細(xì)胞有強(qiáng)大的體外抑制功能。Tregs不僅抑制CD3/CD28抗體誘導(dǎo)的抗原非特異性Vγ2Vδ2 T細(xì)胞的體外擴(kuò)增，而且抑制HMBPP誘導(dǎo)的抗原特異性Vγ2Vδ2 T細(xì)胞的體外擴(kuò)增。此外，Tregs以劑量依賴方式抑制IL-2聯(lián)合HMBPP誘導(dǎo)的正在進(jìn)行中的Vγ2Vδ2 T細(xì)胞的體外擴(kuò)增，并抑制被 IL-2聯(lián)合HMBPP預(yù)先誘導(dǎo)激活的 Vγ2Vδ2 T細(xì)胞的體外繼續(xù)擴(kuò)增。這些證據(jù)表明，Tregs控制Vγ2Vδ2 T細(xì)胞介導(dǎo)的抗結(jié)核免疫［1］，對(duì)正在進(jìn)行中的廣泛地抗結(jié)核感染免疫有強(qiáng)大的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。Tregs可能被用來作為控制正在進(jìn)行中的病原感染的特殊工具。已有報(bào)道［14］，使用 IL-2免疫毒素 Denileukin diftitox(一種IL-2和白喉毒素的融合蛋白)可以減少Tregs的數(shù)量，最終通過加強(qiáng)抗原特異性免疫反應(yīng)增強(qiáng)疫苗介導(dǎo)的T細(xì)胞免疫。

總之，對(duì)Tregs對(duì)Vγ2Vδ2 T細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)作用的了解有利于準(zhǔn)確理解人類免疫系統(tǒng)清除各種病原或有害生物因子以維持免疫系統(tǒng)平衡的機(jī)制，以及應(yīng)用激活的Tregs和Vγ2Vδ2 T細(xì)胞治療感染、腫瘤或其他難治性疾病的相關(guān)機(jī)制。

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