兩種多囊卵巢綜合征大鼠模型造模方法的比較*

賈莉婷，劉艷麗，馬葆靖，張 展，李肖甫，趙德華，張秋菊，郭瑞瑩，宋曉妍，榮守華

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院保健部鄭州450052

(2010-12-27收稿 責(zé)任編輯 趙秋民)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女常見的內(nèi)分泌疾病，其發(fā)病率在育齡婦女中為5% ～10%［1］，發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。現(xiàn)多采用動(dòng)物模型［2-4］研究PCOS的病因、發(fā)病機(jī)制及臨床診斷和治療策略，但模型選擇的正確與否直接影響研究結(jié)果。來曲唑建模法和脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)建模法是國(guó)內(nèi)外使用較多的2種造模方法:來曲唑通過抑制雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化的限速酶芳香化酶的活性，導(dǎo)致體內(nèi)雄激素的增高，動(dòng)物選用6周齡SD雌鼠(相當(dāng)于女性育齡期);DHEA是膽固醇合成雄激素的中間產(chǎn)物，直接導(dǎo)致雄激素的水平增高，動(dòng)物選用23日齡SD雌鼠(相當(dāng)于女性青春前期)。目前對(duì)PCOS模型的評(píng)價(jià)多限于動(dòng)情周期、卵巢形態(tài)和組織學(xué)以及血清激素水平等幾個(gè)方面。作者采用來曲唑建模法和DHEA建模法，在上述評(píng)價(jià)指標(biāo)基礎(chǔ)上，加入雄激素受體(androgen receptor，AR)和黃體生成素受體(luteinizing hormone receptor，LHR)這2個(gè)指標(biāo)，評(píng)價(jià)2種模型的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 分別選用6周齡和23日齡清潔級(jí)SD雌性大鼠各60只，均采用隨機(jī)數(shù)字表分為實(shí)驗(yàn)組、溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組20只［購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(豫)2005-0001］。清潔級(jí)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～24℃，濕度40% ～60%，每天光照10 h，自由飲水，喂以顆粒飼料。

1.2 PCOS模型的建立

1.2.1 來曲唑法 將來曲唑溶于10 g/L羧甲基纖維素(CMC)中，實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃來曲唑1 mg/(kg·d)，溶劑對(duì)照組灌胃10 g/L CMC，均于上午9時(shí)連續(xù)灌服21 d，空白對(duì)照組正常飼養(yǎng)。

1.2.2 DHEA法 將 DHEA溶于0.2 mL甘油中，實(shí)驗(yàn)組大鼠皮下注射DHEA 60 mg/(kg·d)，溶劑對(duì)照組皮下注射0.2 mL甘油，均于上午10時(shí)連續(xù)皮下注射21 d，空白對(duì)照組正常飼養(yǎng)。

1.3 大鼠動(dòng)情周期及體質(zhì)量檢測(cè) 每天對(duì)大鼠進(jìn)行陰道涂片，巴氏染色后觀察動(dòng)情周期的變化;每3 d測(cè)量大鼠的體質(zhì)量并記錄，繪制大鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)變化曲線。

1.4 大鼠血清性激素，卵巢體積、相對(duì)質(zhì)量及組織學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)組在最后一次應(yīng)用來曲唑和DHEA 24 h(并禁食12 h)后，對(duì)大鼠稱量后行乙醚麻醉，快速心臟取血法致死(對(duì)照組選取在動(dòng)情間期)，取血清置－20℃凍存?zhèn)溆茫瑧?yīng)用放射免疫法測(cè)定黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)和睪酮(T)，試劑盒購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。取雙側(cè)卵巢，觀察卵巢形態(tài)學(xué)變化、稱量，用游標(biāo)卡尺測(cè)量卵巢長(zhǎng)、寬和厚度，計(jì)算卵巢體積［5］;根據(jù)大鼠體質(zhì)量和卵巢體質(zhì)量計(jì)算卵巢相對(duì)質(zhì)量［6］。一側(cè)卵巢置于體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛溶液中固定，另一側(cè)卵巢用PBS沖洗后－80℃凍存?zhèn)溆谩Ｒ月殉沧畲笃矫孀鳛榇龣z平面行石蠟包埋，每個(gè)石蠟塊分別以4μm厚度切片2次，行HE染色。

1.5 大鼠卵巢組織中AR、LHR蛋白的檢測(cè) 加入蛋白裂解液研磨大鼠卵巢組織，低溫高速離心后取上清，采用考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合法檢測(cè)蛋白濃度。100 g/L SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，經(jīng)20 V 1 h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用50 g/L脫脂奶粉封閉。AR多克隆抗體(SC-816)、LHR多克隆抗體(SC-25828)均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，抗體均按1∶200稀釋;內(nèi)參為β-actin(購(gòu)自北京博奧森生物公司)，抗體按1∶400稀釋。經(jīng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影，用Biosens Digital System分析目的條帶灰度值，以目的條帶與β-actin灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 大鼠卵巢組織中AR、LHR蛋白的定位 應(yīng)用SP法檢測(cè)卵巢組織中AR、LHR蛋白的定位表達(dá)，一抗同免疫印跡法，抗體按1∶100稀釋。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)分析各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量增加量、卵巢體積、卵巢相對(duì)質(zhì)量、血清性激素水平、AR和LHR蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 PCOS模型大鼠動(dòng)情周期觀察 來曲唑造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠在灌胃12 d后全部失去規(guī)律性動(dòng)情周期，陰道涂片的細(xì)胞學(xué)特征為大量的白細(xì)胞，均處于動(dòng)情間期時(shí)相;DHEA造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠動(dòng)情周期變化極不規(guī)律;各對(duì)照組均保持規(guī)律的動(dòng)情周期。

2.2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量增加量、卵巢體積和卵巢相對(duì)質(zhì)量比較 見表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量增加量、卵巢體積和卵巢相對(duì)質(zhì)量比較

2.3 各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)、組織學(xué)觀察 來曲唑造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢表面較蒼白、包膜增厚，可見大量囊狀卵泡形成;DHEA造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢表面蒼白，囊狀卵泡凸起不明顯;各對(duì)照組大鼠卵巢紅潤(rùn)。來曲唑造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞層減至2～3層，間質(zhì)細(xì)胞增生明顯，卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞多數(shù)缺失，稀見排卵前卵泡和黃體，可見大量囊狀擴(kuò)張卵泡;DHEA造模的實(shí)驗(yàn)組卵巢顆粒細(xì)胞層減少的程度沒有來曲唑造模的實(shí)驗(yàn)組減少的顯著，白膜增厚和間質(zhì)增生不明顯;各對(duì)照組卵巢顆粒細(xì)胞呈多層，多為8～9層。見圖1。

2.4 各組大鼠血清性激素水平比較 見表2、3。

表2 來曲唑造模各組大鼠血清性激素水平比較

表3 DHEA造模各組大鼠血清性激素水平比較

2.5 大鼠卵巢組織中AR、LHR的表達(dá)情況 見圖2、3及表4。AR主要表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞的胞核，呈棕黃色著色，2種造核方法的實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量高于對(duì)照組。LHR表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞的胞質(zhì)及內(nèi)、外膜層細(xì)胞的胞質(zhì)，來曲唑造模的實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量高于對(duì)照組，DHEA造模的實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量略低于對(duì)照組。

圖2 各組大鼠卵巢組織AR(A)、LHR(B)的表達(dá) (SP，×400)1:來曲唑造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠;2:DHEA造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠;3:對(duì)照組大鼠。

圖3 來曲唑法(上)和DHEA法(下)大鼠卵巢中AR、LHR表達(dá)的Western blot檢測(cè)A:實(shí)驗(yàn)組;B:溶劑對(duì)照組;C:空白對(duì)照組。

表4 各組大鼠卵巢組織中AR、LHR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

依據(jù)PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，結(jié)合該研究結(jié)果，從以下幾方面比較2種模型:來曲唑造模的實(shí)驗(yàn)組每次所測(cè)定體質(zhì)量均大于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量增長(zhǎng)量明顯高于對(duì)照組，這與PCOS患者多表現(xiàn)肥胖相符;DHEA造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)量稍低于對(duì)照組，該法不適合于研究肥胖患者。2種方法造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠失去規(guī)律的動(dòng)情周期，提示無排卵。2種造模方法大鼠卵巢均發(fā)生了多囊狀改變，來曲唑造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)和組織學(xué)變化較DHEA造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠更為典型，更適合于卵巢形態(tài)學(xué)的研究。

來曲唑和DHEA均可誘導(dǎo)一種高雄激素的狀態(tài)。來曲唑造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠P水平下降，提示不排卵，和人PCOS一致［7］。在PCOS中，血清LH升高是由P或E2所介導(dǎo)的LH負(fù)反饋［8］。來曲唑通過減少下丘腦-垂體軸E2的產(chǎn)生增強(qiáng)了LH分泌，是一種雙重效應(yīng)。PCOS患者血清LH、LH/FSH異常升高，促進(jìn)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞合成過多雄激素，導(dǎo)致竇卵泡募集亢進(jìn)，最后卵泡發(fā)育停滯，來曲唑造模的實(shí)驗(yàn)組充分證明了這點(diǎn)。但來曲唑造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠E2水平下降，不適合研究雌激素水平較高的PCOS;而DHEA造模的實(shí)驗(yàn)組大鼠血清E2水平明顯增高，適合于雌激素水平較高的PCOS患者研究。

AR是一種配體依賴性的反式轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。PCOS病理狀態(tài)下，體內(nèi)的高雄激素環(huán)境可引起胞質(zhì)內(nèi)AR的核內(nèi)輸入，使核內(nèi)AR水平提高，與免疫組化結(jié)果一致。AR一旦被雄激素激活便能識(shí)別靶因子上專一的DNA序列并與之結(jié)合，從而調(diào)控該基因轉(zhuǎn)錄，表達(dá)新的蛋白質(zhì)，最終使得細(xì)胞的功能發(fā)生改變，靶器官卵巢則出現(xiàn)多囊狀卵泡的形成。2種造模方法的實(shí)驗(yàn)組大鼠AR均高水平，表明高水平的T和AR結(jié)合后參與了多囊狀卵泡的形成。文獻(xiàn)［9-10］通過給雌性大鼠持續(xù)應(yīng)用來曲唑，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)排卵障礙、卵巢多囊樣變，卵巢中AR表達(dá)量增加，與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。血清中LH與卵泡膜細(xì)胞LHR結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)而刺激甾體激素的合成，參與女性生殖過程，如受精卵著床、性腺發(fā)育及功能活動(dòng)的調(diào)節(jié)。PCOS患者血清LH升高可通過誘導(dǎo)卵泡膜細(xì)胞表達(dá)LHR增加，LHR在PCOS患者卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)增加可認(rèn)為導(dǎo)致顆粒細(xì)胞發(fā)生分化、卵泡發(fā)育停滯，持續(xù)性無排卵的一個(gè)指標(biāo)。Jakimiuk等［11］報(bào)道PCOS患者的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中LHR mRNA的高表達(dá)，與作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。總之，兩模型結(jié)果表明大鼠卵巢中AR、LHR參與了多囊狀卵巢形成，可作為PCOS模型蛋白質(zhì)水平的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

綜上所述，無論從傳統(tǒng)的動(dòng)情周期、解剖學(xué)、組織學(xué)、血清學(xué)等方面，還是從增加的蛋白質(zhì)水平比較，來曲唑造模法模型大鼠病理生理特征更接近于人類PCOS特征，是研究該病較為理想的動(dòng)物模型，且較DHEA皮下注射法對(duì)大鼠創(chuàng)傷性小，操作簡(jiǎn)便。

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