結合生物學意義的化學計量學數據處理用于微生物代謝指紋分析

吳 思， 田 晶， 許 衛 萍

( 1.大連工業大學 生物工程學院， 遼寧 大連 116034;2.大連工業大學 現代教育技術部， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

微生物代謝指紋分析已經被廣泛用于微生物的生理、生化和調控等特征的研究，在醫學、環境和工業微生物等領域獲得了很大成功[1-4]。目前代謝指紋分析中常采用的分析技術包括核磁共振 (NMR)、氣相色譜-質譜(GC-MS)、液相色譜-質譜(LC-MS) 以及毛細管電泳-質譜等技術[5-7]。其中GC-MS由于其高靈敏性和具有化合物標準譜庫 (NIST) 而得到了更為普遍的應用[7-8]。

GC-MS代謝指紋分析采用的是EI源，因此一次可以產生大量(化合物碎片)數據，其中包括有價值的信息，還包括了許多干擾信息，有些可能是來源于分析方法，有些來自于分析儀器自身，還有一些來源于樣品本身。這些不可靠數據的存在常常會給代謝指紋分析帶來許多干擾。雖然目前關于代謝指紋分析的原始數據處理和后續的化學計量學分析有許多方法，但是大部分方法更多的是遵循基本的純統計學原則，而沒有更有效地結合生物學意義進行分析[8-11]。為克服上述缺陷，進而能相對合理、準確地利用代謝指紋數據，有效地從龐大的代謝指紋宏數據中分析、提取有價值的信息尤為重要。本研究采用一種結合生物學意義的化學計量學數據處理方法，對不同遺傳背景下的6株大腸桿菌的基本代謝特征進行了分析。

1 實 驗

1.1 試劑和菌株

N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA+1%TMCS)、甲酸、乙腈、吡啶、甲醇、癸酸,均為分析純；實驗用水為Milli-Q水處理機(MILLPORE 美國公司，密理博上海貿易有限公司)產生的高純水。

本研究使用6株不同遺傳背景的大腸桿菌，詳見表1。

表1 實驗菌株

1.2 主要儀器

GC-MS QP2010，日本Shimadzu公司；UV-2450紫外分光光度計，日本Shimadzu公司；Biofuge stratos高速冷凍離心機，德國Kendro公司； LRH-150生化培養箱，上海一恒科技；真空冷凍干燥機FREEZONE4.5，美國Labconco公司。

1.3 培養基及培養條件

葡萄糖培養基使用LB培養基，其主要成分為葡萄糖(1.0 g/L)，蛋白胨(10.0 g/L)，牛肉粉(3.0 g/L)和氯化鈉(5.0 g/L)。果糖培養基以同濃度果糖代替培養基中的葡萄糖，其余成分不變。121 ℃高壓滅菌后，兩種碳源分別以0.22 μm無菌濾膜過濾后以濾液形式加入。培養條件為37 ℃恒溫通氣搖床(160 r/min)培養。

1.4 細胞干重測定

取10 mL發酵液離心所得沉淀，用生理鹽水洗凈后在60～100 ℃的烘箱中烘干5 h，稱重至恒重(g)，即為細胞干重(g)。

1.5 樣品處理方法及GC-MS分析方法

在樣品處理和淬滅中，快速操作對得到精確的代謝物濃度非常重要，因為很多代謝反應變化都很迅速[12]。因此在對數期將菌液離心并涂于平板上生長2～3 h后，取一定量菌體，放到盛有1.5 mL -20 ℃酸乙腈溶液的器皿內，同時加入70 μL 內標溶液癸酸(1 g/L),而后離心吸取上清液1 mL放入冷凍干燥機中凍干。在凍干后的胞內代謝物中加入吡啶50 μL，超生10 min溶解后，再加入BSTFA+1%TMCS60 μL，75 ℃水浴45 min。104r/min離心10 min后取上清用于GC-MS分析。定量結果以內標[13]及細胞干重進行歸一化。

色譜條件：色譜柱，DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm) (J&W, USA)；進樣1 μL，分流比10∶1，70 ℃ (5 min)―5 ℃/min―280 ℃ (5 min)，載氣體積流量,He 1.19 mL/min；MS, 進樣口280 ℃，離子源200 ℃，傳輸線280 ℃;離子掃描,m/z33～550，溶劑延遲6 min；檢測電壓0.9 kV。

2 結果與討論

2.1 不同碳源條件下變化最顯著代謝物的確定

分別在葡萄糖和果糖為唯一碳源培養條件下,對6株大腸桿菌的代謝情況進行GC-MS檢測。經XCMS軟件分析，分別提取出2 002和1 687個有效碎片離子信息。相應信息經由NIST庫和標準品驗證分別得到35和24種胞內化合物相對穩定的定性組分，雖然這些化合物在不同條件下都有一定程度的濃度波動，但是，應該有一種化合物表現為在同一培養條件下、不同菌株之間的濃度變化是最顯著的。為了分別找到在葡萄糖和果糖培養條件下胞內最顯著變化的化合物，作者采用了Tusher等[14]提出的微矩陣顯著性分析策略(Significance Analysis of Microarrays ，簡稱SAM分析)，結果表明在葡萄糖為唯一碳源條件下，最顯著變化的胞內代謝物是谷氨酰胺，而果糖條件下則是尸胺(圖1、2)。

圖1 葡萄糖碳源條件下最顯著變化化合物的SAM分析結果

圖2 果糖碳源條件下最顯著變化化合物的SAM分析結果

2.2 不同碳源條件下相關系數較大代謝物的確定

由于微生物細胞內的代謝活動發生在一個龐大的互動網絡中，因此，一種代謝物的濃度改變必然會引起其他一些相關代謝物的濃度變化，這些代謝物的協同變化特征則主導了微生物的表型特征，因為代謝特征被認為是最接近于生物表型的反應[13]。為了尋找這部分代謝物，作者又以所發現的最顯著變化的代謝物(谷氨酰胺、尸胺)為中心，分別與同條件下檢出的其他代謝物進行Pearson相關分析，其中相關系數大于0.6的代謝物(表2)被篩選出來，這些化合物再進行聚類分析。

表2 不同碳源條件下相關系數大于0.6的化合物

2.3 不同碳源條件下聚類分析結果

不同碳源條件下聚類分析結果見圖3、4。從圖3、4上方聚類線由內向外觀察可以發現，6株菌的主體聚類特征比較相似，即無論在何種碳源條件下，菌株arcA、Y和SA都具有相似的聚類特征，而其他3株菌的特征都與這3株菌比較遠。

大多情況下遺傳特征決定著代謝特征，因此

化合物均經NIST庫檢索，*為同時經標準品驗證

化合物均經NIST庫檢索，*為同時經標準品驗證

在葡萄糖培養條件下具有相似代謝特征的菌株，在果糖條件下也應具有類似的代謝特征。在這3株菌中，arcA基因是與氧供給有關，在該實驗中氧氣供給充足，所以基因并未發揮其調節作用，生長特性與野生株相差不大，而SA菌株在實際的實驗中發現，它有著與arcA較為相似的生長特性。因此至少從arcA、Y和SA這3個樣品來說，本研究中對代謝指紋分析數據的處理是恰當而準確的,結合了生物學特征的數據處理過程，還降低了最終參數的個數。其他3株菌聚類特征之間的差異，可能是由其遺傳特征的特異性改變所致，作者的前期工作結果也一定程度上提示了環境因素對表型的決定作用。

3 結 論

本研究初步證實了結合一定生物學意義的代謝指紋數據處理技術可以相對有效地提取出有價值的信息，利用該方法能在一定程度上避免其他非相關因素對代謝指紋數據的影響，如果能在更大量的不同菌株測試的基礎上對該方法進行驗證和調整，將使代謝指紋分析數據得到更合理的應用。

[1] RAAMSDONK L M, TEUSINK B, BROADHURST D, et al. A functional genomics strategy that uses metabolome data to reveal the phenotype of silent mutations [J]. Nature Biotechnology, 2001, 19:45-50.

[2] COMISH-BOWDEN A, CARDENAS M L. Functional genomics:Silent genes given voice[J]. Nature, 2001, 409:571-572.

[3] van der WERF M J, OVERKAMP K M, MUILWIJK B, et al. Comprehensive analysis of the metabolome of Pseudomonas putida S12 grown on different carbon sources[J]. Molecular Biosystems, 2008, 4:315-327.

[4] BRAUER M J, YUAN J, BENNETT B D, et al. Conservation of the metabolomic response to starvation across two divergent microbes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 2006, 103:19302-19307.

[5] van der GREEF J, STROOBANT P, van der HEIJDEN R. The role of analytical sciences in medical systems biology[J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2004, 8:559-565.

[6] FIEHN O, KOPKA J, DORMANN P, et al. Metabolite profiling for plant functional genomics[J]. Nature Biotechnology, 2000, 8:1157-1161.

[7] KOEK M M, MUILWIJK B, van der WERF M J, et al. Microbial metabolomics with gas chromatography/mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry, 2006, 78:1272-1281.

[8] TIAN Jing, SANG Ping, GAO Peng, et al. Optimization of a GC-MS metabolic fingerprint method and its application in characterizing engineered bacterial metabolic shift[J]. Journal of Separation Science, 2009, 32:2281-2288.

[9] VIEITES J M, GUAZZARONI M E, BELOQUI A, et al. Metagenomics approaches in systems microbiology[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2009, 33:236-255.

[10] MASHEGO M R, RUMBOLD K, de MEY M, et al. Microbial metabolomics:past, present and future methodologies[J]. Biotechnology Letters, 2007, 29:1-16.

[11] van der WERF M J, JELLEMA R H, HANKEMEIER T. Microbial metabolomics:replacing trial-and-error by the unbiased selection and ranking of targets[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2005, 32:234-252.

[12] BUCHHOLZ A, HURLEBAUS J, WANDEREY C, et al. Metabolomics:quantification of intracellular metabolite dynamics[J]. Biomolecular Engineering, 2002, 19(1):5-15.

[13] TIAN J, SHI C, GAO P, et al. Phenotype differentiation of threeE.colistrains by GC-FID and GC-MS based metabolomics[J]. The Journal of Chromatography B, 2008, 871(2):220-226.

[14] TUSHER V G, TIBISHIRANI R, CHU G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 2001, 98:5116-5121.