膠原－殼聚糖復合支架體外三維培養神經干細胞

關 水， 劉 天 慶＊， 葛 丹， 陸 瑞 欣， 馬 學 虎， 崔 占 峰

（1.大連理工大學 大連市干細胞與組織工程研發中心，遼寧 大連 116024；2.牛津大學 工程科學系，英國 牛津 DX1 3PJ）

0 引 言

神經干細胞（neural stem cells，NSCs）體外分離培養的成功及神經生物學發育機制的深入研究，為腦損傷后中樞神經系統功能重建、神經再生和神經系統疾病的治療提供了新的思路和途徑，因此在細胞移植、藥物篩選、轉基因治療及組織工程等方面有著巨大的應用價值［1～4］.但是目前對于NSCs的體外培養主要還是采用傳統的二維培養方式：一種是以神經球（neurosphere）在培養器皿中懸浮（suspension）培養，另一種是在經過處理的培養器皿的表面單層貼壁（monolayer）培養［5、6］.細胞由于脫離體內真實環境而影響生物學行為，因而直接影響了NSCs的數量和活性.體內細胞都是在三維空間中生長、繁殖、分化并發揮其特定的生物學功能的.體外細胞培養的一個重要原則是要最大程度地模擬體內細胞生長環境.不同于傳統的二維培養方式，三維培養（three－dimensional culture）是將細胞種植在一定的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）中，ECM蛋白充當生長支架，為細胞提供三維的結構支承，使細胞間形成適宜的空間分布和細胞連接，而且為細胞提供特異性的生長和分化信號，形成與體內組織相似的細胞生長微環境，從而引導組織形成［7、8］.

三維培養是組織工程中最典型的培養方式，在細胞擴增、組織構建等方面具有重要作用.近幾年來，采用具有三維結構的支架材料進行NSCs的培養已取得了成功［9～11］.2000年，O′connor等將NSCs接種到Ⅰ型膠原凝膠中實現三維培養，發現NSCs能夠在膠原凝膠中增殖并分化為神經元和膠質細胞［10］；2004年，Ma等進一步研究證明，在三維膠原凝膠中，NSCs可以分化為有功能的神經環路，產生的神經元具有神經元極性、神經遞質、離子通道感受器及興奮性的功能［11］.目前國內外對于NSCs三維培養的研究仍處于初級階段，且大多采用膠原作為支架材料，但是純膠原延展性較低，易干裂，抗水性差，遇水易溶脹降解，因此需要通過一定的改性提高膠原的拉伸強度及抗降解能力，從而改善膠原的力學性能與抗水性，以更適合NSCs生長的微環境.殼聚糖作為一種天然多糖衍生物，具有優良的生物親合性，其分子鏈上豐富的羥基和氨基，可發生多種化學反應［12］.殼聚糖與膠原結合能夠形成大分子聚電解質復合材料，可以提高膠原的力學強度，并且可以延遲膠原的降解時間.因此本文針對膠原支架本身存在的不足，采用冷凍干燥法制備膠原－殼聚糖復合支架，建立體外NSCs的三維培養，同時考察NSCs與膠原－殼聚糖復合支架的生物相容性.

1 實驗材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑 實驗所用試劑如下：鼠尾Ⅰ型膠原（CultrexTM，Trevigen Inc.）；殼聚糖（上海伯奧生物科技有限公司）；DMEM 培養液 （Gibco）；RPMI－1640培養液（Sigma）；F12（Gibco）；胎牛血清（華美生物工程公司）；D－葡萄糖 （Gibco）；胰蛋 白 酶 （Gibco）；N2 添 加 劑 （Gibco）；EGF（Gibco）；bFGF （Gibco）；HEPES（Roche）；GlutaMax－1（Gibco）；Heparin（Gibco）；Lipid（Gibco）；B27（Gibco）；BSA（Gibco）；AccutaseTM酶 （Sigma）；Live／Dead Viability－Cytotoxicity Kit（Invitery，USA）.其他所有常規試劑均為分析純.

1.1.2 儀器 實驗所用儀器如下：超凈工作臺（CA－920－3，上海凈化設備廠）；血球計數板（XB－K－25，上海求精生化試劑儀器有限公司）；離心機（Z323，Hermle，Germany）；CO2培養箱（HERA cell，Kendro Laboratory Products，Germany）；超純水機（Millipore－Q－Synthesis，France）；水浴振蕩器（SHA－C，江蘇安普電子工程有限公司）；高壓 滅 菌 器 （SS－325，Tomy Kogyo Co.Ltd.，Japan）；冷凍干燥機（Labconco，USA）；掃描電子顯微鏡（S2520，Hitachi，Japan）；熒光倒置顯微鏡（IX70－131，Olympus Optical Co.Ltd.，Japan）；FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡（Olympus Optical Co.Ltd.，Japan）.

1.1.3 細胞 實驗取孕14d的昆明小鼠（購自大連醫科大學），按照實驗室以前文獻報道的方法［13、14］獲取神經干細胞、進行原代及傳代培養.培養基由 DMEM／F12（1∶1）和 RPMI－1640按比例混合作為基礎培養基，添加生長因子及其他成分構成（其中 EGF，20ng·mL－1；bFGF，10 ng·mL－1；Heparin，4mg· mL－1；HEPES，5 mmol／L；D－葡萄糖，9.151g·L－1；GlutaMax－1，4.5mmol／L；BSA，2mg·mL－1；加適量NaHCO3調節pH至7.2）.本實驗采用第三代細胞.

1.2 方 法

1.2.1 支架制備、交聯及修飾

（1）制備

稱取一定質量的殼聚糖粉末，完全溶解于2%的乙酸，配制成20mg／mL殼聚糖溶液，離心除渣脫泡待用；膠原（CultrexTM，溶解于20 mmol／L乙酸中）儲存于2～8℃待用，儲備液的濃度為5mg／mL.分別將膠原與殼聚糖溶液按體積比9∶1、7∶3、5∶5充分混勻，離心除泡后加入預冷的96孔板中（每孔100μL），置于－84℃超低溫冰箱內預凍2h后迅速轉移至低溫冷凍干燥機中12h，再浸入0.1mol／L Na2HPO4（pH 7.4）中數小時以中和殘留的乙酸，然后用蒸餾水反復沖洗至中性，再冷凍干燥8h，即得殼聚糖－膠原復合支架.

（2）交聯

將凍干后的支架小心取出，轉移至24孔板內，加入2mL含50mmol／L 2－嗎啉乙烷磺酸、50 mmol／L碳化二亞胺及50mmol／L N－羥基琥珀酰亞胺的體積分數為0.4的乙醇交聯劑中室溫交聯6h，移去交聯劑，加入0.1mol／L Na2HPO4（pH 7.4）室溫孵育2h，再用體積分數為0.4的乙醇清洗4次，30min／次，雙蒸水反復洗至中性，最后將24孔板置于超低溫冰箱內預凍2h，再次冷凍干燥，即得交聯后的支架.

（3）修飾

將經環氧乙烷滅菌過的交聯的膠原－殼聚糖復合支架置于24孔板內，將100μL（10μg／mL）的層粘連蛋白（LN）小心懸滴于支架中，并將孔板置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中過夜，無菌干燥后保存備用.

1.2.2 支架孔徑、孔隙率、吸水率及降解率測 定

（1）孔徑（aperture）

取以上制備的不同比例的復合支架，真空噴金導電處理后黏貼在金屬模塊上，在掃描電子顯微鏡下觀察支架材料內部的微觀結構.選擇合適的放大倍數拍攝掃描照片，并在材料內部選取3個視野，每個視野測量10個孔徑值，計算支架的平均孔徑.

（2）孔隙率（porosity）［15］

測量支架的質量，記為m0，體積記為V0，將支架浸入無水乙醇（密度為ρ0）中24h，使乙醇溶液充分進入到支架材料中，然后小心地將支架取出，表面擦干，稱其質量，記為m，則支架內孔的體積Vp＝（m－m0）／ρ0，每個樣本測3 次，取平均值.支架孔隙率ε（%）按下式計算：

（3）吸水率（water absorption）

測量支架的質量，記為m0，浸泡到三蒸水中24h后再次稱重，記為m1，每個樣本測3次，取平均值.支架吸水率A（%）按下式計算：

（4）降解率（degradation rate）

取12支20mL試管分成4組，每組3支，分別加入制備好的不同比例的干燥復合支架（質量記為m0），再加入10mL含溶菌酶1×105U 的0.1mol／L磷酸緩沖液（pH 7.4），置于37℃水浴中振蕩消化.分別于1、2、3、4、5和6周取出各組樣本，蒸餾水洗后冷凍干燥，稱重，記為mt.支架降解率D（%）按下式計算：

1.2.3 支架內細胞接種率的測定及分布觀察根據孔隙率選取體積比為7∶3的膠原－殼聚糖復合支架，將NSCs小心接種在支架上，細胞接種的初始濃度為5×106個／mL，體積為20μL；未經LN處理的支架作為對照組.接種率（%）按下式計算：

培養4d后，加入10μg／mL Hoechst33342，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中孵育10 min，然后加入預冷的4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定細胞（與培養液按1∶3混合），10min后取出支架，用PBS蕩洗3次，用刀片切成薄片（平均厚度50～100μm），于熒光顯微鏡下觀察.

1.2.4 細胞死活檢測 細胞以5×106個／mL的初始濃度分別接種于不同體積比的膠原－殼聚糖復合支架中，體積為20μL，置于24孔板內在37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養.采用Live／Dead Viability－Cytotoxicity Kit檢測細胞在支架內的存活.Live／Dead Viability－Cytotoxicity Kit含有測量細胞活力的兩種熒光探針.活細胞能夠與鈣黃綠素（calcein AM，4mmol／L）結合，在激發光的作用下發出強烈的綠色熒光；而死細胞由于細胞膜的破損，細胞內的核酸能夠與乙啡啶同型二聚體（EthD－1，2mmol／L）結合，在激發光的作用下產生強烈的紅色熒光.具體操作方法按照說明書進行，采用激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察.

1.2.5 統計學分析 各組實驗分別重復3次，所得數據以“平均數±標準誤差”表示，學生t檢驗進行顯著性分析，以P＜0.05認為有顯著性差異.

2 結果與討論

2.1 膠原－殼聚糖復合支架的微觀結構

本研究通過冷凍干燥法制備的膠原－殼聚糖復合支架為白色、不透明、表面粗糙，具有一定彈性的規則圓柱體（底面直徑約為6mm，高約為3 mm），有的呈纖維狀排列并有大小不等的隆起，用手觸摸感覺有彈性.圖1所示為膠原－殼聚糖復合支架（7∶3）在掃描電鏡下的超微結構，可以非常清楚地看到支架上較大范圍內的孔結構，孔與孔之間相互連通形成孔道.但從圖1（a）中也可以看到，支架多孔結構的某些區域仍然不是很均勻，這可能是由于在膠原和殼聚糖溶液混合過程中攪拌不勻產生了氣泡，經預凍后形成了較大的結冰區，導致支架在凍干時局部冰晶直接升華，從而產生了所謂的“無孔區”.

圖1 膠原－殼聚糖復合支架的微觀結構Fig.1 The microstructure of collagen－chitosan composite scaffolds

2.2 膠原－殼聚糖復合支架的性能特征

支架的孔隙形態，包括孔隙率、孔徑大小和孔徑分布等對細胞增殖速度、支架降解動力學特性和組織的力學特性等有著重要的影響.因此，組織工程中使用的支架不僅要求其材料具有生物相容性、生物可降解性，還要求具有高孔隙率、高比表面積、孔隙內部連通性好等特性，以便于組織液擴散和組織的形成.本實驗所制備的不同體積比的膠原－殼聚糖復合支架的孔徑、孔隙率、吸水率、降解率等參數如表1及圖2所示.

表1 膠原－殼聚糖復合支架的孔徑、孔隙率、吸水率Tab.1 The aperture，porosity and water absorption of collagen－chitosan composite scaffolds

圖2 膠原－殼聚糖復合支架的體外降解率Fig.2 The degradation rate of collagen－chitosan composite scaffolds in vitro

由表1可以得出，隨著殼聚糖比例的增加，復合支架的孔徑逐漸減小，吸水率逐漸增大，而孔隙率沒有明顯的變化.這些結果說明通過冷凍干燥法制備的不同比例的膠原－殼聚糖復合支架，都具有較高的孔隙率（90%左右），具備孔與孔之間的連通，但是連通孔徑之間存在一定的差別.膠原比例太大，使得復合支架更加致密，孔壁變厚，孔徑變大，孔的數量減少，且分布不均.而且隨著膠原蛋白含量的增加，吸水率逐漸降低，導致降解速度加快.

膠原在體內由膠原酶迅速降解，而殼聚糖則主要由體液中的溶菌酶降解.這兩種酶在體內的含量不同，當溶菌酶分解了包裹在膠原纖維外的殼聚糖后，膠原酶才能對膠原纖維進行降解［16］，因此實驗中僅采用溶菌酶考察膠原－殼聚糖復合支架的降解速率.由圖2可見，隨著時間的延長，不同體積比的膠原－殼聚糖復合支架的降解率同趨勢增加，且隨著殼聚糖比例的增加，支架的降解率呈依賴性提高，即5∶5支架的降解率明顯高于7∶3和9∶1實驗組的.需要指出的是，生物材料的體內降解受多種酶的聯合作用，不完全同于體外降解情況，所以膠原－殼聚糖在溶菌酶中的模擬降解只能宏觀上評價不同體積比支架的體外降解趨勢的快慢.

以上結果表明，體積比為5∶5、7∶3、9∶1的膠原－殼聚糖復合支架的孔徑、孔隙率、吸水率、降解率等實驗參數都符合體外細胞培養的要求.考慮到孔徑及其均勻性的差別，在以后的實驗中，主要采用體積比為7∶3的膠原－殼聚糖復合支架來進行NSCs的三維培養.

2.3 膠原－殼聚糖復合支架與NSCs的生物相容性

要實現NSCs在支架材料內的三維培養，首先要求細胞很好地接種在支架材料上.細胞與支架材料的黏附是組織工程研究細胞與材料間相互作用的基礎.影響黏附的因素主要有生物學和材料學兩個方面.就材料學方面來說，材料表面的親疏水性、表面自由能、荷電特性等對材料的黏附性都存在較大的影響.細胞和膠原－殼聚糖支架的結合在很大程度上依靠糖蛋白的連接.層粘連蛋白（LN）能夠為細胞在支架上的黏附提供良好的基質膜環境，提高細胞與支架的黏附率.NSCs能夠連結LN的第11位氨基酸，再由LN短臂上的球形結構與Ⅰ型膠原結合，從而使細胞與支架黏附得更牢固.

因此本文首先考察了NSCs在經過LN修飾的膠原－殼聚糖支架（7∶3）內的接種率.由表2可以看出：最初接種的細胞密度較高，但補加新鮮培養基之后，有一部分細胞重新從支架上脫離，懸浮于培養基中.在孵育12h后，置換培養器皿時計數得到30%～40%的細胞因為黏附不牢而脫落.所以，要保證支架內的細胞總數，開始的接種密度一定不能太低（一般高于1×106個／mL）.對比2個實驗組可以看出，LN處理能夠明顯提高NSCs的接種率.

表2 NSCs在膠原－殼聚糖支架（7∶3）內的接種率Tab.2 The inoculation rate of NSCs in collagen－chitosan（7∶3）scaffolds

通過Hoechst熒光染色，本文進一步考察了NSCs在經過LN修飾的膠原－殼聚糖復合支架（7∶3）中的生長和分布情況.如圖3所示，在經LN修飾的支架上，細胞黏附的數量明顯多于未經過修飾的.因此，經過LN修飾后的支架材料大大改善了細胞在支架上的黏附能力，顯著提高了膠原－殼聚糖支架材料的生物相容性及對細胞的親合力，對細胞的黏附行為產生了不可忽視的影響.

圖3 膠原－殼聚糖（7∶3）支架中NSCs的Hoechst熒光染色觀察Fig.3 Hoechst fluorescence staining of NSCs in collagen－chitosan（7∶3）scaffolds

激光共聚焦掃描顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）是20世紀80年代發展起來的一種高精度分子細胞生物學分析儀器，輔以各類免疫熒光探針或熒光染料與被測物質特異性結合，不僅可觀察固定的細胞組織切片，還可以對活細胞的結構、分子、離子進行實時動態觀察和檢測.因此通過Live／Dead Viability－Cytotoxicity Kit染色，應用LSCM技術，實時檢測了NSCs在經過LN修飾的膠原－殼聚糖（7∶3）支架內細胞的死活情況.如圖4所示，培養6d后，活細胞的比例（圖4（a），69.2%）明顯大于死細胞的（圖4（b），30.8%）.但由圖4（c）可以看出，單位細胞數量多的區域死細胞的數量也相應增加（如圖中方框所示，即圖4（a）與圖4（b）疊加后區域），這可能是由于在一定空間內的細胞數量過多，造成營養物質缺乏而導致細胞凋亡.圖4（d）為 NSCs在Z軸（1.50mm×1.50mm×0.24 mm）上疊加的三維成像照片，表明支架內的NSCs培養至第6d時狀態良好，細胞仍然保持著旺盛的增殖能力.

圖4 NSCs在經過LN修飾的膠原－殼聚糖（7∶3）支架內 Live／Dead Viability－Cytotoxicity Kit染色Fig.4 Staining of NSCs in LN－treated collagen－chitosan（7∶3）scaffolds by using the Live／Dead Viability－Cytotoxicity Kit

圖5為NSCs在經過LN修飾的膠原－殼聚糖（7∶3）支架內增殖和分化的掃描電鏡照片.圖5（a）顯示了NSCs以球狀或團簇狀黏附于支架的孔壁或孔隙內；而圖5（b）則顯示NSCs附著在孔道壁上，分化的神經突觸向外伸展，并相互交織呈網狀.這個結果進一步證明了膠原－殼聚糖復合支架具有良好的生物相容性并提供適合NSCs生長的微環境，NSCs能夠在支架內良好地生長、增殖及分化.

圖5 NSCs在經過LN修飾的膠原－殼聚糖（7∶3）支架內生長情況的掃描電鏡觀察Fig.5 The growth state of NSCs in LN－treated collagen－chitosan（7∶3）scaffolds via SEM

3 結 語

三維培養作為體外二維細胞系統的研究與組織器官及整體研究的橋梁，既能保留體內細胞微環境的物質及結構基礎，又能展現細胞培養的直觀性及條件可控性優勢.近幾年來，隨著干細胞與組織工程技術的新興發展，三維培養在組織形成、血管發育和器官再造等發育生物學的分支領域得到了廣泛的應用；同時在篩選新藥的療效分析和毒理實驗方面，利用三維培養獲得了和二維培養方式完全不同的結果，也引起了藥理學家的極大興趣［17］.本文采用冷凍干燥法制備了膠原－殼聚糖復合支架，通過層粘連蛋白進行結構修飾，并測定了其物理性能特征，建立了胎鼠海馬神經干細胞（NSCs）的三維培養體系.通過孔徑、孔隙率、吸水率、降解率等參數的比較得出，體積比為7∶3的復合支架更適合于體外細胞培養的要求；激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察表明，NSCs能夠在膠原－殼聚糖復合支架內良好地生長、增殖及分化.這些結果對于NSCs的進一步臨床移植應用，以及治療神經系統疾病的新藥篩選和機理研究等有明確的理論和工程實用意義.然而由于技術條件的原因，目前體外三維培養所創建的培養條件僅處于亞最佳狀態，培養的細胞僅具備有限的生存能力和有限的分化程度，仍然有待于進一步發展和完善.

［1］KULBATSKI I，MOTHE A J，NOMURA H，etal.Endogenous and exogenous CNS derived stem／progenitor cell approaches for neurotrauma ［J］.Current Drug Targets，2005，6（1）：111－126

［2］MARTINO G，PLUCHINO S.The therapeutic potential of neural stem cells ［J］.Nature Reviews Neuroscience，2006，7（5）：395－406

［3］MCLEOD M， HONG M， SEN A，etal.Transplantation of bioreactor－produced neural stem cells into the rodent brain ［J］.Cell Transplantation，2006，15（8－9）：689－697

［4］RUBIN L L.Stem cells and drug discovery：the beginning of a new era［J］.Cell，2008，132（4）：549－552

［5］REYNOLDS B A， WEISS S.Clonal population analyses demonstrate that an EGF－responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell［J］.Developmental Biology，1996，175（1）：1－13

［6］GAGE F H.Mammalian neural stem cells ［J］.Science，2000，287（5457）：1433－1438

［7］NAKAJIMA M，ISHIMURO T，KATO K，etal.Combinatorial protein display for the cell－based screening of biomaterials that direct neural stem cell differentiation［J］.Biomaterials，2007，28（6）：1048－1060

［8］ALAVI A，STUPACK D G.Cell survival in a threedimensional matrix ［J］.Methods in Enzymology，2007，426：85－101

［9］YANG F， XU C Y， KOTAKI M，etal.Characterization of neural stem cells on electrospunpoly（L－lactic acid）nanofibrous scaffold［J］.Journal of Biomaterials Science－Polymer Edition， 2004，15（12）：1483－1497

［10］O′CONNOR S M，STENGER D A，SHAFFER K M，etal.Primary neural precursor cell expansion，differentiation and cytosolic Ca2＋response in threedimensional collagen gel［J］.Journal of Neuroscience Methods，2000，102（2）：187－195

［11］MA W，FITZGERALD W，LIU Q Y，etal.CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three－dimensional collagen gels ［J］.Experimental Neurology，2004，190（2）：276－288

［12］FREIER T，KOH H S，KAZAZIAN K，etal.Controlling cell adhesion and degradation of chitosan films by N－acetylation ［J］.Biomaterials，2005，26（29）：5782－5878

［13］劉天慶，戴明舒，葛 丹，等.神經球內神經干／祖細胞活性與代謝研究［J］.大連理工大學學報，2008，48（6）：811－818（LIU Tian－qing，DAI Ming－shu，GE Dan，etal.Study of viability and metabolism parameters of NSPCs ［J］.Journal of Dalian University of Technology，2008，48（6）：811－818）

［14］關 水，劉天慶，葛 丹，等.原兒茶酸對體外培養的神經干／祖細胞增殖及凋亡的影響［J］.中國藥理學通報，2009，25（4）：448－452

［15］WANG Y C，LIN M C，WANG D M，etal.Fabrication of a novel porous PGA－chitosan hydrid matrix for tissue engineering ［J］.Biomaterials，2003，24（6）：1047－1057

［16］HIRANO S，ZHANG M，NAKAGAWA M，etal.Wet spun chitosan－collagen fibers，their chemical N－modifications， and blood compatibility ［J］.Biomaterials，2000，21（10）：997－1003

［17］PAMPALONI F，REYNAUD E G，STELZER E H.The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue［J］.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2007，8（10）：839－845