Survivin和Caspas3在側向發(fā)育型大腸腫瘤中的表達

吳曉冬,張 斌,李長鋒,楊 蕾,李丹丹,丁 夢

(吉林大學中日聯誼醫(yī)院1.中心研究室;2.內鏡中心,吉林長春130033)

大腸癌在我國是高發(fā)腫瘤之一,而且大腸腫瘤有一個從“腺瘤-癌順序學說”,所以有很多學者致力于研究癌基因、抑癌基因及凋亡相關基因等在大腸癌變過程中的改變,并且得出結論:它們在大腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中演繹著重要角色。隨著放大內鏡及其內鏡黏膜切除術(EMR)等技術的臨床應用,大腸側向發(fā)育型腫瘤(laterally spreading tumor,LST)逐漸受到人們的注意,其主要特性為病變主要沿黏膜面?zhèn)认虮頊\生長,而不是向腸壁深層垂直生長[1]。

由于對LST認識不足,現國內外對其發(fā)病機制尚缺乏系統(tǒng)的研究,LST由于其具有沿黏膜水平生長的特點,認為可能與腫瘤細胞的異常增殖及凋亡有關。細胞凋亡受凋亡促進因子和凋亡抑制因子的共同調節(jié)。Caspase是細胞凋亡的核心機制,其級聯反應的激活決定了凋亡形態(tài)的變化。而Survivin是近些年發(fā)現的一種腫瘤特異性凋亡抑制因子,故本研究擬探討良性LST與垂直生長的大腸腺瘤間凋亡相關基因Caspase3和Survivin的表達異同。

1 材料和方法

1.1 研究對象 LST、大腸腺瘤、大腸腺癌及正常組織標本均取自吉林大學中日聯誼醫(yī)院內鏡中心和基本外科2002-2006年治療和診斷的患者,術前均未接受過化療及放療,由病理醫(yī)師進行復查確診。其中23例良性LST患者:男性13例,女性 10例,年齡27-75歲,平均年齡53.6歲;34例大腸腺瘤患者:男性19例,女性15例,年齡22-74歲,平均年齡49.7歲;21例大腸腺癌患者:男性12例,女性9例,年齡34-78歲,平均年齡58.7歲;11例正常黏膜組織標本取自距腫瘤邊緣10cm以上的正常黏膜組織。

1.2 免疫組化染色 SP免疫組化試劑盒及Caspase3、Survivin兔抗人多克隆抗體均購自福州邁新生物工程公司,DAB顯色試劑盒購自博士德生物工程公司,按照試劑盒說明進行免疫組化檢測。用PBS代替一抗作為陰性對照,用已知陽性標本作為陽性對照。

1.3 結果判斷 圖象分析儀進行圖象分析,每張圖片選擇5個視野,測定陽性蛋白的吸光度值并判斷陽性率。Survivin和Caspase3蛋白均定位于細胞漿內,免疫組織化學染色陽性反應為黃-棕黃色顆粒。雙盲法看片,參照Kawasaki等[2]采用的半定量積分方法判斷結果。

1.4 統(tǒng)計學分析 所有數據均采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析,P＜0.05表示差異有顯著意義。

2 結果

2.1 Survivin表達 良性LST組(陽性率21.7%,吸光度122.3±13.55)和大腸腺瘤組(陽性率20.6%,吸光度126.8±12.26)表達明顯低于大腸腺癌組(陽性率61.9%,吸光度 107.7±10.24)(P＜0.05),而良性LST組與腺瘤組間未見顯著差異(P＞0.05)(見表1)。

表1 正常大腸黏膜和大腸腫瘤組織中Survivin基因蛋白產物的表達

2.2 Caspase3表達 良性LST組(陽性率60.9%,吸光度值106.8±15.77)和腺瘤組(陽性率64.7%,吸光度值108.5±15.63)明顯高于腺癌組(陽性率42.9%,吸光度值129.5±8.67)(P＜0.05),Caspase3在正常黏膜中廣泛表達于胞漿中,而良性LST組與腺瘤組相比沒有統(tǒng)計學差別(P＞0.05)(見表2)。

表2 正常大腸黏膜和大腸腫瘤組織中Caspase3基因蛋白產物的表達

3 討論

Survivin是IAP(inhibitor of apoptosis proteins)家族的新成員,Survivin僅有一個桿狀病毒IAP重復區(qū)結構(Baculorirus IAP Repeat,BIR),沒有羧基末端環(huán)指結構,代之的是羧基末端卷曲結構。Survivin基因定位于17q25[3],是功能類似Bcl-2的抑制凋亡基因。有研究表明Survivin調節(jié)線粒體釋放細胞色素c抑制凋亡,也可直接與 caspase3和 caspase7結合,使caspase的活性降低而抑制凋亡,也有報道Survivin還可以調節(jié)G2/M細胞周期,主要以細胞周期依賴的形式過度表達于G2/M期[4]。另外,Survivin有保護細胞、維持微管結構完整性的作用?？傊?Survivin是在正常組織中不表達,在胚胎時期高表達,在惡性腫瘤發(fā)生時又重新表達的一類因子,可以使腫瘤細胞免于凋亡,加速其多倍體的形成,促進腫瘤生成。

本實驗證明了在LST中有Survivin的高表達。且從正常大腸黏膜到腺瘤、LST以及最終癌變的發(fā)展過程中Survivin表達逐漸增加,而良性LST與腺瘤在表達上沒有顯著差異(P＞0.05)。與Lin等[5]的研究結果一致,由此也說明其重新表達的時機為腫瘤發(fā)生的早期,所以我們考慮Survivin過度表達是大腸癌發(fā)生的早期事件之一,即在腺瘤早期Survivin已被激活,表達出大量Survivin蛋白,抑制細胞凋亡,延長腫瘤細胞生存期,無論是水平生長還是垂直生長的大腸腫瘤都有其表達。這使得Survivin成為大腸腫瘤的早期診斷指標之一。

由于Survivin的抗凋亡功能主要是通過在Bcl-2的下游干擾 caspase-9或直接抑制caspase3和caspase7的活性來實現[4],Caspase家族是一種半胱氨酸蛋白酶家族,其家族成員有十余種,它們激活某些酶或破壞細胞骨架等方式導致一系列凋亡相關反應及細胞形態(tài)改變。Caspase是以酶原形式存在的,只有被激活才能發(fā)揮作用,活化的Caspase再通過裂解相應的一系列底物而引起細胞凋亡。目前認為與Caspase有關的細胞凋亡途徑至少有三種:細胞色素c途徑、死亡受體途徑及內質網途徑,其共同途徑都是最終激活Caspase3。所以Caspase3是Caspase凋亡途徑中的核心成員。Caspase總是與其抑制劑共存,以防止Caspase酶原意外激活而對正常細胞造成損傷。Survivin即被認為是Caspase的抑制劑之一。故我們同時檢測了Caspase3的在大腸腫瘤中的表達。Caspase3在正常黏膜高表達,隨著大腸腫瘤的發(fā)生,腺瘤組及良性LST組Caspase3表達降低,大腸癌組的Caspase3表達明顯降低。說明Caspase3的表達受到抑制,從而也抑制了凋亡途徑,使腫瘤生長。證明了LST組織細胞凋亡的改變也是由于多種基因協同作用的結果。

以上結果在良性LST與大腸腺瘤間未見Caspase3、Survivin等基因的差異改變,考慮LST與大腸腺瘤同樣是癌前病變,LST同樣存在多基因改變,同時由于LST在內鏡下容易被忽視,故提示內鏡工作者在工作中,要提高警惕,以防漏診。另外,由于內鏡技術的發(fā)展,特別是內鏡黏膜下剝離術(ESD)及內鏡黏膜下切除術(EMR)的應用[6],也使其盡早診斷,急早治療成為可能。

[1]Kudo S,About laterally spreading tumor[J].Early colorectal Cancer,1998,2(5):477.

[2]Kawasaki H,Altieri DC,L u CD,et al.Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer[J].Cancer Res,1998,58(22):5071.

[3]Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel anti apoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med,1997,3(8):917.

[4]Tamm I,Wabg Y,Saysville E et al.IAP-family protein survivin inhibits caspase activite and apoptosis induced by Fas(CD95),Bax,caspases,and anticancer drugs[J].Cancer Res,1998,58:5315.

[5]Lin Li,Zheng CQ,Jin Y,et al.Expression of survivin protein in human colorectal carcinogenesis[J].World J Gastuoenterol 2003,9:974.

[6]Iizuka H,Okamura S,Onozato Y,et al.Endoscopic submucosal dissection for colorectal tumors[J].Gastroenterol Clin Bilo,2009,33(10-11):1004.