轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2)在老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮細(xì)胞中mRNA表達(dá)的差異

李桂榮,周鴻雁,張文松*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科醫(yī)院,吉林長春130041;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院眼科)

晶狀體上皮細(xì)胞的異常增生、分化及凋亡是白內(nèi)障發(fā)生的機(jī)制之一。國外有研究表明,生長因子、尤其是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)在白內(nèi)障發(fā)生過程中起著重要的作用[1]。本研究將TGF-β2在老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮細(xì)胞中mRNA表達(dá)進(jìn)行比較,以探討TGF-β2在老年性白內(nèi)障的形成及發(fā)展中作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)組為北京朝陽醫(yī)院2005年老年性白內(nèi)障患者白內(nèi)障超聲乳化術(shù)中所得的晶狀體前囊膜。共42例,均為不同年齡的老年性白內(nèi)障,男26例,女16例,平均年齡為63.4歲±8.2歲,對照組為健康成年眼球晶狀體的前囊膜,共15例,為青壯年。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒;RT-PCR試劑盒;dNTPs(10mM);Taq 酶(2 U/μ l);β-Actin(25 pmol/μ l),均為北京鼎國生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。

1.1.3 引物 從PUBMED/Nucleotide GenBank中查出人TGF-β2基因序列,β-actin序列作為內(nèi)參照。應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。

引物由北京奧科生物公司合成。引物的序列如下 :TGF-β2:上游引物 5′-ACGGGGCGGGGCGGTGGA-3;下游引物 5′-CCGACCCTCCTCCTTCAC-3′,片段長度 :220 bp。β-actin:上游引物 5′-ATCCATGTTTGAGACCTTCAACACC-3′;下游引物 5′-CATGGTGGTGCCGCCAGACAG-3′,片段長度:552 bp。

1.2 方法

1.2.1 cDNA的合成 提取兩組晶狀體前囊膜中總RNA,并以此逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 以β-actin作為內(nèi)參,將其與待測得目的基因同時(shí)擴(kuò)增,分兩管相同體系進(jìn)行。按試劑盒說明書操作。

1.2.3 瓊脂糖電泳 分別取兩管反應(yīng)管中5 μ l擴(kuò)增產(chǎn)物和上樣緩沖液0.3 μ l點(diǎn)樣后90 V電泳1 h,凝膠用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察,并進(jìn)行半定量分析。圖像分析儀測照片上擴(kuò)增產(chǎn)物的平均灰度,計(jì)算出其基因表達(dá)量與其對應(yīng)的內(nèi)參β-actin表達(dá)量的比值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組兩兩比較采用方差分析,取 P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β2在老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮細(xì)胞中mRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

結(jié)果如圖1所示:條帶552 bp處為PCR陽性內(nèi)參β-actin基因mRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物,條帶220 bp處為TGF-β2mRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖a為老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞的TGF-β2基因的擴(kuò)增產(chǎn)物,圖b為正常對照組晶狀體上皮細(xì)胞的TGF-β2基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1 TGF-β2在老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮細(xì)胞中mRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 TGF-β2在老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮細(xì)胞中mRNA表達(dá)的差異

圖像分析儀檢測瓊脂糖凝膠上TGF-β2擴(kuò)增產(chǎn)物的平均灰度,其基因表達(dá)量與其對應(yīng)的β-actin表達(dá)量的比值,老年性白內(nèi)障組為0.37±0.06,正常對照組為0.26±0.06,兩組比較差異有顯著性(P＜0.01)。

3 討論

研究表明,在老年性白內(nèi)障發(fā)生過程中最早發(fā)生的是晶狀體上皮的損害。并且在白內(nèi)障形成時(shí)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生多種退行性及增殖性改變。老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞改變最終是以細(xì)胞凋亡為主[2]。而晶狀體是沒有血液供應(yīng)的器官,晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、分化和凋亡主要依靠細(xì)胞外的基質(zhì)、細(xì)胞因子、細(xì)胞密度等來調(diào)控。

TGF-β是一類人體大多數(shù)細(xì)胞都能夠分泌的細(xì)胞因子,它是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的多肽。在體內(nèi)廣泛存在。哺乳動物有三種亞型:TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。其中TGF-β2主要存在于眼內(nèi),其它組織中幾乎不含TGF-β2[3]。TGF-β2具有雙向細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)的功能,它一方面促進(jìn)人及動物晶狀體上皮細(xì)胞增殖,分化和成熟;另一方面又具有抑制細(xì)胞增殖的作用[4]。TGF-β2還可誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。TGF-β2可以引起體外培養(yǎng)的晶體上皮細(xì)胞發(fā)生白內(nèi)障樣損害,并且這種損害可以被抗體所阻斷[5]。這就提示了TGF-β2在白內(nèi)障的發(fā)生中起到了某種作用。

本研究結(jié)果顯示,老年性白內(nèi)障組的晶狀體上皮細(xì)胞中TGF-β2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的平均灰度,其基因表達(dá)量與其對應(yīng)的β-actin表達(dá)量的比值為0.37±0.06,正常對照組為0.26±0.06,兩組比較差異有顯著性(P＜0.01)。提示TGF-β2可能參與了老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡,從而對老年性白內(nèi)障的發(fā)生起著一定的作用。TGF-β2因子對晶狀體上皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)還需進(jìn)一步的進(jìn)行研究。以期為將來預(yù)防和治療老年性白內(nèi)障提供一條新的途徑。

[1]Li WC,Kuszak JR,Dunn K,et al.Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals[J].J Cell Biol,1995,130(1):169.

[2]蔡小軍,楊桂芳,陳貴芹.老年核性及皮質(zhì)性白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞密度及增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)[J].湖北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,21:333.

[3]Ohta K,Yamagami S,Taylor AW,et al.IL-6 antagonizes TGF-beta and abolishes immune privilege in eyeswith endotoxin-induced uveitis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2000,41:2591.

[4]Sun JK,Iwata T,Ziglel JS,et al.Differential gene expression in male and female rat lenses undergoing cataract induction by TGF-β[J].Exp Eye Res,2000,70(2):169.

[5]Hales AM,Chamberlain CG,McAvoy JW.et al.Cataract induction in lensescultured with transforming growth factor-beta[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1995,36:1709.