三種檢測系統測定糖化血紅蛋白相關性分析及偏倚評估

童華誠,劉 慧,張 美,馬敏敏

(南京同仁醫院 醫學檢驗科,江蘇 南京211101)

糖化血紅蛋白是血紅蛋白與糖類經非酶促反應結合而成的.它的合成過程是緩慢且不可逆的,其血液濃度反映測定前2-3個月機體平均血糖水平。血液糖化血紅蛋白水平被視為糖尿病血糖控制的“金標準”,在臨床上得到廣泛應用[1]。

目前臨床實驗室常用的HbA1c測定方法主要是離子交換高效液相色譜法(HPLC)、免疫法及親和層析法三大主流方法?，F階段,我國臨床實驗室不同檢測系統之間測定HbA1c的結果往往差異很大,臨床上難以作出合理評價,應用受到嚴重限制[2]。

本文針對目前臨床上有代表性的三種檢測系統測定HbA1c的結果作比較研究,對HbAlc測定值的可比性和偏倚程度予以分析報告。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 收集本院門診及住院糖尿病患者和健康體檢者EDTA抗凝全血,共64份,血標本在采集后6 h內檢測完畢。

1.1.2 儀器和試劑 (1)檢測系統一:美國Bio-Rad D-10 HPLC糖化血紅蛋白分析儀及其原裝試劑和校準品(試劑批號:1號液,AA01911;2號液,AA01912;wash液,AA01913。校準品批號:Level 1-AA00927,Level 2-AA00928);(2)檢測系統二:瑞士羅氏公司Roche Cobas全自動生化分析儀,免疫法,Roche公司Tina-Quant HbA1cⅡ試劑和校準品(批號:158507-01)。(3)挪威Axis-Shield公司Afinion AS100分析儀,親和色譜法,原裝進口的配套測試卡及校準品(批號:10146319);(5)質控品:檢測系統一、二均使用伯樂公司HbA1c質控品(批號:Level 1-33801,Level 2-33802);檢測系統三使用Afinion AS100分析儀專用質控品(批號:260311)。

1.2 方法

1.2.1 操作方法 D-10 HPLC法及Afinion親和色譜法測定糖化血紅蛋白為全自動分析,按儀器使用說明書操作;Roche免疫法需要對全血樣本進行預處理后上機測定。

1.2.2 相關性分析 參照 CLSI EP9-A2評價方案[3],每天收集新鮮標本8份,分別用4種檢測系統對這8份樣本按順序1→8進行樣本測定,再按相反順序8→1重復測定,8天共完成64份樣本測定,記錄測定結果。HPLC法是目前公認測定HbAlc的參考方法,本試驗以D-10離子交換HPLC法測定結果為參照,計算每個樣本3種方法測定結果的均值、每個樣本3種方法重復測定值間差值的絕對值及其他2種方法(Y)與參考方法測定結果(X)均值間的差值,按EP9-A2文件進行方法內及方法間離群值檢查并去除離群值,計算線性回歸方程Y=bX+a。參考檢測系統(X)的測定范圍是否合適,可用相關系數(r)做粗略估計,如r≥0.975(或r2≥0.95),則認為X的分析范圍合適,可以用直線回歸計算斜率、截距,依據已給定的HbA1c醫學決定水平Xc,計算待驗證的檢測系統(Y)與參考檢測系統(X)之間的相對偏差(SE%)。如r＜0.975,則使用配對t檢驗對測定結果進行分析,并計算出待驗證的檢測系統與參考檢測系統均值的相對偏倚。相對偏倚可接受性判斷參照衛生部臨床檢驗中心公布的HbAlc室間質量評估的允許誤差,允許偏倚根據公式:(Xc×允許誤差)/2計算,Xc為HbA1c的醫學決定水平,預期偏倚計算公式:a+(b-1)Xc。計算比對系統(Y)與參考系統(X)之間的相對偏差(SE%)。如果預期偏倚小于允許偏倚則為可接受,否則為不可接受[4]。

1.2.3 不精密度測定 檢測系統一和二均使用伯樂公司提供的高低兩個水平的質控品,檢測系統三Afinion AS100分析儀只適用挪威Axis-Shield公司提供的專用高低兩個水平質控品,每批每個濃度雙份測定,相隔2 h以上,每天2次,連續測定20天,檢測其批內不精密度和批間不精密度。

1.2.4 統計學分析 統計學分析采用Microsoft Excel 2007,SPSS 13.0統計軟件?；貧w分析采用Passing-Bablok回歸,回歸線性檢測采用Cusum方法檢測,P＜0.05表示線性回歸偏倚有統計學意義。相關性分析采用Pearson相關,P＜0.05表示相關具有統計學意義。偏倚分析采用Bland-Altman方法。

2 結果

2.1 三種檢測系統測定糖化血紅蛋白相關性和相對偏倚分析結果 對三種檢測系統測定64例血液樣本HbA1c的數據經方法內離群點的檢驗及方法間配對結果離群點的檢驗,均未發現離群點。以D-10 HPLC法測定值(X)為參照,對 Roche免疫法結果(Y)進行回歸統計得到方程Y=0.9704X+0.3545,r=0.992,P＜0.01;對Afinion親和色譜法測定值進行回歸統計得到方程Y=1.032X-0.061,r=0.996,P＜0.01,相關系數均大于0.975,P＜0.01,提示Roche免疫法、Afinion親和色譜法與D-10 HPLC法測定結果具有顯著相關性,并表明D-10 HPLC法測定值(X)的分布范圍符合要求,可以用b和a作誤差的估計(見圖1、2)。衛生部臨床檢驗中心公布的HbA1c室間質量評估允許誤差為總體均值±20%,根據允許偏倚公式:(Xc×允許誤差)/2計算,Xc為HbA1c檢測試驗的醫學決定水平,因此,HbA1c檢測的允許偏倚為(6.2%×±20%)/2=±0.62%,依據預期偏倚計算公式:a+(b-1)Xc,Roche免疫法和Afinion親和色譜法測定結果預期偏倚絕對值分別為0.17%和0.13%,均小于允許偏倚0.62%。

2.2 不精密度測定結果 三種檢測系統分別測定高低兩個水平的質控品每批每個濃度雙份測定,D-10 HPLC法和Afinion親和色譜法平均總CV分別為2.0%、1.6%和1.7%、1.3%;Roche免疫法測定HbA1c總CV%分別為4.1%和3.7%,約為另外兩個檢測系統CV%的1倍以上,三種檢測系統平均批內、批間和總CV%見表1。

圖1 Roche免疫法與D-10 HPLC法線性分析

表1 三種檢測系統測定HbA1c(%)的變異系數

圖2 Afinion親和色譜法與D-10 HPLC法線性分析

3 討論

糖化血紅蛋白的測定方法有幾十種之多,這些檢測方法基本上可分為兩大類:一類是基于糖化血紅蛋白與血紅蛋白電荷不同,如離子交換層析法、電泳法;另一類是基于血紅蛋白上糖化基團的結構特點,如親和層析法、免疫法、離子捕獲法和酶法等[2]。各種方法和檢測設備測定HbA1c結果的準確度、精密度都有所差異,而實現同一檢驗項目在不同檢測系統之間測定結果的可比性是臨床實驗室質量管理的最終目標。國際臨床化學與檢驗學聯合會(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,IFCC)于1995年成立了糖化血紅蛋白標準化工作組,經過多年研究探索,研發了糖化血紅蛋白的參考物質和參考測定方法[5-6],極大地促進了HbA1c測定的標準化進程。

方法學比對試驗是實現測量結果準確度溯源和患者標本檢驗結果可比性的重要途徑。本研究參照EP9-A2文件,對三種檢測系統測定HbAlc結果進行比對和偏倚評估。本實驗結果表明,三個檢測系統測定HbAlc的不精密度均符合美國國家糖化血紅蛋白標準化項目(NGSP)確定的小于5%的要求。實驗方法與參考方法的比對結果可以接受,則可認為實驗方法的準確度可以溯源,不同檢測系統的檢驗結果具有可比性。實驗檢測系統與參考檢測系統之間的相對偏倚低于允許偏倚,因此實驗檢測系統測定HbAlc結果是可靠的,不需要重新校準。

Bio-Rad D-10全自動糖化血紅蛋白儀和Afinion AS100分析儀分別使用使用HPLC法及親和色譜法全自動測定HbA1c,結果不易受到人為因素影響,在臨床應用過程中應按照儀器使用手冊的指導加強維護保養并定期校準。應用免疫學方法在生化分析儀上測定HbA1c,需要手工吸取血樣本與溶血素混合,徹底破壞紅細胞后上機測定,易引入人為因素誤差來源。本實驗表明,免疫法較HPLC法或親和色譜法總不精密度高出1倍以上,免疫法測定結果應定期與HPLC法或親和色譜法進行比對。如果使用免疫法檢測糖化血紅蛋白,應采用多點定標方式,密切關注室內質控結果的變化,確保在試劑的開瓶有效期內使用。如果采用非配套的儀器、試劑和校準品等則應按照CLSI標準化文件要求作自建檢測系統的性能驗證,以確保檢驗結果的準確可靠以及與其他實驗室、其他檢測系統之間結果報告的一致性。

[1]International Expert Committee.International Expert Committee reporton the role of the HbA1c assay in the diagnosis of diabetes[J].Diabetes Care,2009,32:1327.

[2]王冬環,張傳寶,陳文祥,等.應重視糖化血紅蛋白測定技術及其量值溯源[J].中華檢驗醫學雜志,2008,31:965-968.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI).Method comparison and bias estimation using patient samples[S].ApprovedGuideline-second edition.Document EP9-A2[S].Wayne,PA.2003.

[4]李義龍,單戰海,韓 冰,等.酶法糖化血紅蛋白試劑盒方法學比對評價[J].中國實驗診斷學,2010,14(8):1336.

[5]Jeppsson JO,Kobold U,BarrJ,et al.Approved IFCC reference method for the measurement of HbAlc in human blood[J].Clin Chem Lab Med,2002,40(1):78.

[6]Hoelml W,Weykemp C,Jeppmon JO,et al.IFCC reference system for hemoglobin Alc in human blood and the national standardization schemes In the United States,Japan,and Sweden:method-comparison study[J].Clin Chem,2004,50(1):166.