多藥耐藥銅綠假單胞菌耐藥性及相關(guān)耐藥基因分析

趙祝香,陳惠玲,魏樹全,趙子文,葉惠芬

(廣州醫(yī)學(xué)院附屬廣州市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,廣東廣州510180)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是下呼吸道感染、ICU感染的首要病原菌,而且可造成一定程度的院內(nèi)感染流行。我國全國性監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示:從1994年到2009年,PA在所有院內(nèi)感染的革蘭陰性菌中排第1位[1,2]。由于廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用,所有廣譜抗生素對銅綠假單胞菌的敏感性都在下降,目前出現(xiàn)了對3類或3類以上抗生素耐藥扔多藥耐藥銅綠假單胞菌(MDRPA),甚至出現(xiàn)了僅對粘菌素敏感的泛耐藥銅綠假單菌(PDRPA),多藥耐藥成了銅綠假單胞菌感染的一個(gè)嚴(yán)重的問題[3]。如2004年北京協(xié)和醫(yī)院報(bào)道有44例MDRPA院內(nèi)感染,死亡 24例,好轉(zhuǎn) 20例,病死率為 55%[4]。多藥銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜,目前尚不甚清楚,銅綠假單胞菌膜蛋白o(hù)prD基因的缺失、產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶和外排泵MexAB-OprM高表達(dá)可能是其主要的耐藥機(jī)制,本研究以此為基礎(chǔ),選擇相關(guān)耐藥基因?yàn)闄z測對象,了解臨床分離的MDRP相關(guān)耐藥基因的存在情況。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 從廣州市第一人民醫(yī)院2009年01月至2010年10月住院患者臨床標(biāo)本收集銅綠假單胞菌1 394株,利用紙片擴(kuò)散法篩選出多重耐藥的菌株,對3類或3類以上抗菌藥物耐藥的菌株判定為多重耐藥銅綠假單胞菌,共40株,其中從痰液分離菌株32株、中段尿3株、創(chuàng)傷和傷口分泌物5株;按病區(qū)分布,老年病科(10)株,中心重癥監(jiān)護(hù)病房(8)株、呼吸內(nèi)科(7)株、神經(jīng)內(nèi)科(4)株、泌尿外科(3)株、外科(3)株。質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌(ATCC35218)和銅綠假單胞菌(ATCC27853),由默沙東公司贈送。

1.1.2 試劑 哌拉西林(PIP)、氨曲南(ATM)、頭孢他啶(CAZ)、環(huán)丙沙星(CIP)、亞胺培南(IPM)、頭孢吡肟(PEP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、慶大霉素(GEN)8種抗生素藥敏紙片,購自英國Oxoid公司。PCR引物由英駿生物技術(shù)有限公司(invitrogen)合成具體見表1。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、4種dNTP混合液(25 mmol/L)、DNA 分子量Marker均購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.1.3 儀器 生物梅里埃公司VITEK2全自動細(xì)菌鑒定儀,Biometra PCR擴(kuò)增儀。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 采用K-B藥敏實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)操作規(guī)程、質(zhì)量控制和藥敏結(jié)果判斷依據(jù)根據(jù)2009年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解釋。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA模板的制備細(xì)菌DNA的提取 用接種環(huán)挑取純菌落接種于5 ml LB肉湯培養(yǎng)液,將裝有LB培養(yǎng)液的試管置于震蕩培養(yǎng)箱中,37℃,200轉(zhuǎn)/分,18-20小時(shí)培養(yǎng)至細(xì)菌生長對數(shù)期。然后取3 ml培養(yǎng)液,按照天跟生化公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行操作,提取的DNA模版置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)和PCR反應(yīng)條件 PCR引物序列及預(yù)期產(chǎn)物大小見表1。

表1 PCR擴(kuò)增相關(guān)耐藥基因引物

各種靶基因PCR擴(kuò)增體系均為:總反應(yīng)體積20 μ l,其中 P1、P2 引物各 1 μ l,Premix Taq DNA 聚合酶10 μ l,滅菌蒸餾水 7 μ l,模板液 1 μ l。 熱循環(huán)參數(shù)根據(jù)目的產(chǎn)物大小有所不同,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物＞500 bq的基因熱循環(huán)參數(shù)為:93℃預(yù)變性3 min,93℃變性60 s、退火溫度(如表1)退火60 s、72℃延伸 60 s,35個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min;用雙蒸滅菌水作模板設(shè)陰性對照。反應(yīng)結(jié)束后取5 μ l PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,核酸染液染色,同時(shí)加核酸電泳相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒定擴(kuò)增DNA片段的大小。用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 按計(jì)數(shù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 多藥耐藥銅綠假單胞菌的體外藥敏結(jié)果 40株多藥耐藥銅綠假單胞菌臨床常用抗假單胞菌藥物的體外抗菌活性見表2。這些菌株對臨床常用的多種藥物大部分耐藥,耐藥率由高到低依次為厄它培南,亞胺培南(IPM)、頭孢他啶(CAZ)、美羅培南、頭孢吡肟(PEP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、環(huán)丙沙星、氨曲南(ATM)、慶大霉素(GEN)、妥布霉素、阿米卡星、多粘菌素,其中對厄他培南天然耐藥,對常用抗假單胞菌抗菌素均大于50%以上,對亞胺培南(IPM)、頭孢他啶(CAZ)、美羅培南耐藥率均高達(dá)90%以上,對多粘菌素B未出現(xiàn)耐藥。

表2 多藥耐藥銅綠假單胞菌體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2 多藥耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株的耐藥基因PCR檢測

外膜蛋白D2(oprD2)基因檢測40株多藥耐藥銅綠假單胞菌中,oprD2基因缺失26株,缺失率為65.0%,部分oprD2基因陽性菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜見圖1;整合酶陽性9株,檢出率為22.5%;金屬酶陽性1株,其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖2、圖3;氨基糖苷類修飾酶基因ant3Ⅰ(如圖4)、aac6Ⅱ基因多見,ant2Ⅰ、aac6Ⅰ陽性率也較高。同時(shí)攜帶2種或2種以上耐藥基因占55.0%,攜帶2種以上氨基糖苷類修飾基因的有40.0%,耐藥基因種類見表3。

圖1 外膜蛋白OPRD2缺失基因擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 整合子INTⅠ基因擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 金屬酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4 氨基糖苷糖類ant3Ⅰ基因擴(kuò)增產(chǎn)物

表3 40株銅綠假單胞菌基因型構(gòu)成

3 討論

多藥耐藥銅綠假單菌感染使臨床醫(yī)生抗感染治療面臨選藥困難的處境,從我們的藥敏結(jié)果中可以看到,40株MDRPA對臨床常用抗生素的耐藥率在100%至22.60%之間,對厄它培南天然耐藥,對β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類均顯示出很高的耐藥性。頭孢他啶和亞胺培南是常見的抗銅綠假單胞菌藥物,但耐藥率均較高,加上還有一定的中介率,多藥耐藥銅綠假單胞菌對上述兩種抗生素的敏感率不到30%。氨曲南是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的單環(huán)β內(nèi)酰胺類抗生素,由于對多種質(zhì)粒介導(dǎo)和染色體介導(dǎo)的β內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定,常用于需氧革蘭陰性桿菌如腸道桿菌和銅綠假單胞菌所引起的各種抗感染治療[5]。但本研究顯示,MDRPA對氨曲南的敏感率僅33.00%,說明臨床醫(yī)生如憑經(jīng)驗(yàn)選擇抗菌素來治療MDPRA感染,可能導(dǎo)致患者死亡率增加,甚至造成銅綠假單胞耐藥菌株的傳播。

由于銅綠假單胞菌耐藥率不斷增加,存在區(qū)域差異,目前還不十分清楚,了解多藥耐藥銅綠假單胞菌耐藥的分子機(jī)制研究成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。銅綠假單胞菌可通過外膜蛋白o(hù)prD2基因缺失而導(dǎo)致對亞胺培南等β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。oprD2是外膜蛋白中亞胺培南和β內(nèi)酰胺類酶抑制劑進(jìn)入菌體的特異性通道,如外膜蛋白缺失,藥物難以到達(dá)其靶作用位點(diǎn),從而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥。本研究40株MDRPA菌株中oprD2基因缺失26株,缺失率為65%,同時(shí)攜帶多種耐藥基因的比率較高,與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)有所差異。產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶是細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生耐藥的主要原因。按酶的功能可將氨基糖苷類修飾酶分成乙酰轉(zhuǎn)移酶(aac)、磷酸轉(zhuǎn)移酶(aph)和核苷轉(zhuǎn)移酶(ant)。本研究ant3Ⅰ基因的陽性率為36.0%,其它氨基糖苷類修飾酶基因aac6Ⅱ、aac6Ⅰ、ant2Ⅰ基因陽性率分別為35.1%、26.2%,20.1%,同一菌株同時(shí)攜帶2種以上氨基糖苷類修飾基因的42.0%,可以看出本地區(qū)氨基糖苷類修飾酶基因?qū)︺~綠假單胞菌的耐藥性起到重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)有一株銅綠假單胞菌所檢測基因全部陰性,但也表現(xiàn)出高度耐藥性,提示可能存在其它耐藥機(jī)制,有待于進(jìn)一步研究。

整合子具有捕獲、切除、重排耐藥基因的能力,并且能在啟動子的作用下使之轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄曰虻谋磉_(dá)單位,是一種通過轉(zhuǎn)座子或接合質(zhì)粒將金屬酶在內(nèi)的多種耐藥基因在細(xì)菌中水平傳播。整合子在整合酶的催化下,通過整合酶識別耐藥基因盒并整合到自身的染色體上,并使其表達(dá),從而使細(xì)菌獲得耐藥性。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前已有超過130多種耐藥基因盒可以整合在整合子上,可以編碼臨床上幾乎所有抗生素的抗性基因[6]。在整合子介導(dǎo)的耐藥機(jī)機(jī)制中,I類整合子起著非常重要的作用,本研究中共檢出I類整合子菌株9株,陽性率22.5%,提示攜帶多種耐藥基因盒的整合子存在也是細(xì)菌多藥耐藥的原因之一。

銅綠假單胞菌多藥耐藥在全世界范圍內(nèi)的傳播將會成為全人類重大的健康安全隱患,應(yīng)引起臨床廣泛關(guān)注。合理使用抗感染藥物,采取有效措施控制耐藥菌株的出現(xiàn)、及時(shí)切斷多階段重耐藥菌株的水平傳播,顯得尤為重要。

[1]汪 復(fù),朱德妹,胡付品,等.2009年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志,2010(05):325.

[2]孫景勇,倪語星,汪 復(fù),等.2007年中國CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志,2009(03):192.

[3]Barbier F,Wolff M.Multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa:towards a therapeutic dead end[J].Med Sci(Paris),2010,26(11):960.

[4]曹 彬,王 輝,朱元玨,等.多藥耐藥銅綠假單胞菌院內(nèi)感染危險(xiǎn)因素及預(yù)后因素分析[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2004,27(1):31.

[5]崔紅利,陳東風(fēng).氨曲南的臨床應(yīng)用[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2008(13):1983.

[6]Partridge SR,Tsafnat G,Coiera E,Iredell JR.Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons[J].FE MS Microbiol Rev,2009,33(4):757.