外周血淋巴細胞培養及制備染色體G顯帶的技術研究

韓 晶,李 洋

(1.安陽市人民醫院 檢驗科,河南安陽455000;2.吉林大學第一醫院)

人們用物理、化學因素處理后,再用染料對染色體進行分化染色,使每條染色體上出現明暗相間,或深淺不同帶紋的技術稱為顯帶技術(banding technique)。染色帶的數目、部位、寬窄和著色深淺均具有相對穩定性,所以每一條染色體都有固定的分帶模式,即稱帶型。染色體帶型是鑒別染色體的重要依據。染色體分帶技術可分為兩大類,一類是產生的染色帶分布在整條染色體的長度上如:G、Q和R帶;另一類是局部性的顯帶,它只能使少數特定的區域顯帶,如C、T和N帶[1]。G帶即吉姆薩帶,是將處于分裂中期的細胞經胰酶或堿、熱、尿素等處理后,再經吉姆薩染料染色后所呈現的區帶,是目前被廣泛應用的一種帶型。其特性是顯帶方法簡單恒定,帶型穩定,保存時間長[2]。資料表明,外周血淋巴細胞培養及染色體G顯帶標本制備技術是細胞遺傳學研究的基礎。近幾年來,有關細胞遺傳技術方法方面外周血淋巴細胞培養的報道較少,本文在此基礎上自2006年1月-2009年9月進行680例細胞培養,600份G顯帶制備技術處理總結實驗方法,現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗對象

我院自2006年1月-2009年9月門診咨詢者680例,其中包括婦產科、新生兒等住院患者,外周血淋巴細胞培養后制備的染色體標本。

1.2 實驗試劑與器材

1.2.1 實驗器材 分析天平,隔水式電熱恒溫培養箱,恒溫水浴鍋,離心管,離心機(北京時代北利),載玻片,顯微鏡(OLYMPUS-CX21),標本板,玻璃鉛筆,定時鐘,染色缸,直柄虹膜鑷,滴管。

1.2.2 實驗試劑 肝素抗凝劑(反復高壓后4℃冰箱中保存),RPMI1640、植物細胞凝集素(Phaseolus vulgaris,PHA),pH6.8 PBS,Giemsa,0.025%胰蛋白酶(取0.9%氯化鈉100 ml,加0.25%胰蛋白酶1 ml),0.75%的低滲液,0.50%秋水仙素(-10℃反復凍融保存),胰酶粉(顯帶前現配現用)

1.3 實驗方法

1.3.1 染色體標本培養 取患者外周血2毫升,5毫升注射器針頭28-32滴于RPMI1640培養基中,放置于37℃培養箱中培養72 h;培養終止后,離心后將細胞提取出,所獲得的外周血淋巴細胞依次用0.75%mol/LKCL溶液低滲以及固定液固定,制成細胞懸液;后取潔凈冷濕的載玻片,吸取適量細胞懸液,滴于載玻片上(每片3-4滴),經酒精燈外延加熱烘烤至干燥[3]。

1.3.2 G顯帶標本制備[4]將制好的染色體標本,置85℃烤箱中烤片2 h;放入預溫至37℃的0.025%胰酶溶液中(pH=7.2-7.4)消化1.5 min左右,每次的作用時間并不完全相同,可先試一張片子,再根據顯帶效果調整胰酶作用時間;在Giemsa染液中染色15 min,自來水沖洗干凈,晾干后,即可閱片;鏡檢:在顯微鏡高倍目鏡下檢查顯帶標本,在染色體上若出現清晰的深淺相間的帶型,即為可取標本。

2 結果

2.1 細胞培養成功率

680例以各個染色體分布舒展,相對集中少重疊為準,于40倍光鏡下觀察到1號、7號、11號、14號及X六條帶紋特征性較強的染色體,培養成功率為96.62%(658/680)。取其中培養合格的600分進行下一步的顯帶處理。

2.2 G顯帶制備合格率 G顯帶處理共計600張片。以100倍光鏡下觀察2號、4號、6號、13號、17號、20號以及22號共計7對染色體特征性帶紋區域清晰可辨認為準,其顯帶合格率為91.67%(550/600),合格標準見表1。

50例失誤操作采取補救措施,效果分析,失誤率為8.00%(4/50),其成功率為92.00%(46/50),結果見表2。

表1 染色體G顯帶制備技術鏡下鑒定合格標準

表2 50例失誤操作補救措施效果觀察

3 討論

近幾年來,隨著人們對保健意識的不斷增強,染色體檢查已經逐漸在臨床檢查中普及,而且常用的外周血淋巴細胞培養是一個復雜并且繁瑣的過程,在實際的臨床工作過程中需要一周左右的時間才能正常的完成,同時,實驗過程中若有一個過程出現紕漏,就極有可能導致實驗的失敗[5]。接種血樣時要保持標本的新鮮,最好是在采用24 h內對外周血淋巴細胞進行培養,如果不能進行培養,可以放置于4℃的冰箱中保存,但保存時間不易過長,防止細胞活力的降低。對培養過程中出現血樣凝集的現象,可以將培養瓶輕輕震蕩,使凝塊散開,后放入37℃恒溫箱中培養。導致培養失敗的主要因素是抗生素、消炎藥以及高膽紅素等的干擾,抑制淋巴細胞從而影響細胞培養的質量,對標本的采集應避開用藥近期或新生兒高膽紅素血癥期。

1978年有報道標本總量(試劑+細胞)的總體積為4.0ml[6],本文研究發現當采用4.0ml低滲液,固定劑時,對染色體去膜化解旋、舒展、膨脹等并無影響。離心過程中應控制轉速為2000 r/min,防止染色體的丟失[7]。體積堆積的細胞沉淀物可以避免操作過程中因碰顫而導致的沉淀物的懸浮。另一方面,烤片也是不容忽視的操作環節。烤片不僅是老化過程,同時可以蒸發殘留于標本片上的固定劑,同時將用于浸泡載玻片的乙醇酸類等物質徹底蒸發,從而利于消化液pH環境[8]。按照以上條件,本研究結果外周血淋巴細胞培養合格率為96.62%(658/680)。資料報道,G顯帶技術有7種[9],其中主要以胰酶消化為主。胰蛋白酶濃度和處理時間隨氣溫高低有所不同。一般規律是標本存放時間越長,在胰蛋白酶當中處理時間越長。太新鮮的標本,染色體會出現毛茸現象。片齡很長的標本往往會導致斑點狀的染色體[10]。本實驗通過研究,制備過程中臨時配制胰酶溶液,用玻璃毛細血管蘸取少許胰酶粉溶解于0.90%的鹽水中,配制成0.30%的胰酶溶液,消化時間6.5 h。G顯帶技術制備的合格率為91.67%(550/600)。

其中,染色對顯帶同樣也是至關重要,Gimesa是噻嗪類染料,其組成成分天青B與蛋白質中的DNA分子中的磷酸基結合,蛋白質在一定的環境中,同時具有嗜酸性及嗜堿性的傾向,通過調節染色液的pH值7.0-7.5,復染7 min,可以獲得較為鮮亮的顯色效果。綜上所述,通過對外周血淋巴細胞的培養及G顯帶各個制備環節的分析,提高了染色體制備技術的穩定性及成功率。

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[7]張國慶,焦順昌,林星石.人外周血淋巴細胞體外擴增培養前后19種細胞表型研究[J].軍醫進修學院學報,2008,29(5):352.

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