PCR結合反向膜雜交快速鑒定臨床常見念珠菌方法學的建立

李 娟,李從榮,李 艷,顧 劍

(武漢大學人民醫院檢驗科,湖北武漢430060)

深部真菌感染往往繼發于其他系統性疾病,臨床表現不典型,容易與原發病相混淆,診斷比較困難,而治療時機的延誤往往導致高感染率和高死亡率。來自美國休斯頓的一項研究表明,早期抗真菌治療可極大改善病人預后[1]。

念珠菌屬是深部真菌感染中最常見的病原菌,且存在天然耐藥現象。本研究以18S rDNA基因和5.8S rDNA基因的保守序列設計真菌通用引物,以內轉錄間隔區ITS1段設計種特異性探針,利用PCR結合反向膜雜交技術,達到快速檢測臨床常見致病念珠菌的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株及生物學試劑 白色念珠菌,熱帶念珠菌,近平滑念珠菌,都柏林念珠菌,光滑念珠菌,克柔念珠菌,均是來源于衛生部臨檢中心質控菌株;季也蒙念珠菌;葡萄牙念珠菌;毛霉菌;清酒酵母;新生隱球菌;曲霉菌均由本院微生物室從臨床標本中分離。Taq DNA聚合酶,10×PCR buffer,MgCl2,dNTPs;DNA marker,TE緩沖液(pH 8.0);TdT末端脫氧核苷轉移酶;尼龍雜交膜;dTTP均由日本TaKaRa公司公司提供。凱普雜交配套試劑:由凱普科技生物公司提供。

1.1.2 引物及探針的設計

①參考Catriona Halliday[2]等人設計的通用引物擴增真菌轉錄間隔區ITS1。Its1F:19TCCGTAGGGAA CCTGCGG37;its1R:237CGCTGCGYTCTTCATCGATG208。3'端均采用生物素標記。

②根據ITS1基因序列多態性設計探針[3]

探針序列(5'→3') Tm(℃)C.albicans TTTATCAACTTGTCACACCAGA 68.4 C.tropicalis CTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACC 64.5 C.krusei TGTGGAATATAGCATATAGTCGACAAGAG 64.8 C.glabrata TGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATC 68.2 C.dubliniensis ACATGTGTTTTGTTYTGGACAAACTTG 67.3 C.parapsilosis CTGCCAGAGATTAAACTCAACCAA 65.1

陽性對照探針:TCCGTAGGGAACCTGCGG

1.2 方法

1.2.1 采用蛋白酶K-SDS法提DNA[4],置于4℃備用。

1.2.2 PCR 反應 10×PCR Buffer 2.5 μ l,2.0 mmol/L dNTP 2.5 μ l,1.5 mmol/L MgCl21.5 μ l,10 pmol/L生物素標記的上、下游通用引物各1 μ l,0.5 U Taq DNA 聚合酶 1.0 μ l,DNA 模板 5 μ l,雙蒸水補足至25 μ l。97℃預變性10 min后,進入循環。95℃變性3 min,53℃退火30 s,72℃延伸60 s,35個循環后,72℃延伸7 min。

1.2.3 反向膜雜交 雜交膜的制備:5×dTTP buffer 4 μ l,TdT 4 μ l,dTTP 5 μ l,10 pmol oligo 1 μ l,雙蒸水補足至 20 μ l體積,于 37 ℃水浴60 min,后加入 2 μ l 0.5 mmol/L EDTA,70℃s水浴10 min行終止反應。然后將上述反應液點滴于尼龍雜交膜上。在紫外燈下照射2 min,后烘干備用。按此方法制備含陽性對照探針以及目標探針的尼龍膜。

雜交前操作前準備:按照凱普雜交儀使用說明進行操作。

雜交:置PCR產物于PCR儀做解鏈反應(變性)(95℃5 min,4℃2 min以上),同時向雜交膜上加45℃雜交液500 μ l,孵育2 min以上。開泵吸走殘余雜交液 ,將變性PCR 產物20 μ l與500 μ l 45℃雜交液混合,加于雜交膜上,蓋板孵育10 min。開泵吸走雜交液,洗膜2次。調整雜交儀溫度為25℃,加500 μ l封阻液封閉5 min后吸走封阻液。此時溫度應在25±3℃,加入500 μ l酶標液,孵育3.5min后吸走 。調整雜交儀溫度為 36℃,加溶液A500 μ l洗膜 3次。之后加入顯色劑NBT/BCIP 500 μ l顯色 3 min,吸走顯色劑后加溶液B500 μ l洗膜3次。漂洗一次。取出雜交膜,閱讀結果,藍紫色圓點為酶學反應陽性點。

2 結果

2.1 引物的通用性和特異性評價

圖1 通用引物擴增產物電泳圖譜

8株實驗菌株均能通過PCR擴增出相應的產物,大小為218 bp,以下幾種臨床分離株:曲霉菌、毛霉菌、清酒酵母、新生隱球菌均能擴增出相應的產物,大小從200 bp-500 bp不等(見圖1)。

2.2 試驗菌株雜交結果

反向膜雜交均能將念珠菌鑒定到種(見圖2-7),且所有基因型別可以在同一張膜上進行檢測(見圖8),而正常人類基因組DNA及臨床常見的幾種真菌雜交結果均為陰性。

圖2 白色念珠菌雜交圖譜

圖3 熱帶念珠菌雜交圖譜

圖4 近平滑念珠菌雜交圖譜

圖5 都柏林念珠菌雜交圖譜

圖6 光滑念珠菌雜交圖譜

圖7 克柔念珠菌雜交圖譜

圖8 六種念珠菌同時雜交圖譜

2.3 鑒定時間的比較

整個檢測過程包括雜交膜的制備、臨床標本DNA的提取、PCR反應以及蓋板雜交,共耗時約5-6個小時,由于雜交膜事先可以制備好,并可在常溫干燥環境存放半年左右,故整個檢測過程實際上最短在3-4小時內即可完成,而傳統的培養方法至少需耗時48小時。

3 討論

深部真菌病的死亡率往往在40%以上,特別是ICU病房的重癥患者,深部真菌感染的死亡率更高,由于其臨床表現缺乏特異性,確診仍依賴于組織中發現真菌成分和相應的陽性培養結果,但這些傳統的方法敏感性不高,往往容易失去最佳救治機會,因此,如何提高真菌感染的早期、特異診斷水平是目前臨床真菌學領域的研究熱點,也是臨床檢驗工作中亟待解決的問題。將病原真菌鑒定到種水平的臨床意義主要在于藥物選擇,因為不同菌種對抗真菌藥物的敏感性不同,如克柔念珠菌對氟康唑天然耐藥、對兩性霉素B不夠敏感;光滑念珠菌對氟康唑不夠敏感;土曲霉、波氏假霉樣真菌、毛孢子菌等對兩性霉素B天然耐藥;接合菌對除泊沙康唑外的唑類藥物均不敏感等[5]。如果鑒定結果發現這些真菌,將可避免臨床用藥上的偏差。

目前臨床上分離的深部真菌仍以念珠菌屬為主,霉菌的分離率相對較低,美國馬塞諸塞州在2008-2009兩年內對79個醫學中心監測的真菌血培養陽性的1239例病原菌進行分析發現,白色念珠菌仍居于首位,達到50%,其余依次為光滑念珠菌17.4%,近平滑念珠菌17.4%,熱帶念珠菌9.8%,克柔念珠菌1.8%[6]。

真菌的 rDNA基因是一種串聯重復基因,即18SrDNA-ITS1-5.8SrDNA-ITS2-28SrDNA轉錄單位,分隔18S、5.8S、28SrDNA基因亞單位的序列稱為內轉錄間隔區(internal transcribed space,ITS),為非編碼區。由于ITS區不加入成熟核糖體受到的選擇壓力較小,進化速率較快,在絕大多數的真核生物中表現出了極為廣泛的序列多態性。同時ITS序列長度適中,序列中有足夠的信息,可廣泛用于屬內種間或種內群體的系統學研究[7]。

PCR結合反向膜雜交技術,是用生物素標記通用引物,PCR擴增得到的產物變性后與固定在尼龍膜上的特異性探針進行雜交,探針捕獲的生物素和標記堿性磷酸酶的鏈酶親合素特異性結合后,酶催化底物顯色,在尼龍膜上顯出藍紫色斑點。這樣使得特異性得到大大提高,同時SA-AP標記顯色系統也使得檢測靈敏度得到提高。

本實驗結果顯示,所選用的探針均能檢測出相應的靶序列,每張膜上只有陽性對照點和與靶序列對應的探針點有陽性結果,其他探針點均為陰性。6種念珠菌的PCR產物與膜雜交,在特異性探針位點上均出現雜交斑點,表明此方法可檢測幾種菌的混合感染。由于尚未設計霉菌、清酒酵母、隱球菌的檢測探針,因此,這三種菌的PCR擴增結果為陽性,雜交結果均為為陰性,而正常人類基因組DNA擴增結果及雜交結果均為陰性。結果表明,實驗中設計使用的探針未有非特異性的交叉反應,可以對真菌進行種間分型檢測,顯示了較好的特異性和敏感性。

另外,整個檢測過程包括雜交膜的制備共耗時約5-6個小時,由于雜交膜事先可以制備好,并可在常溫干燥環境存放半年左右,故整個檢測過程實際上最短在3個小時內即可完成,而傳統的培養方法需要耗時約48小時,這對于指導臨床科學用藥,減少因經驗性治療導致的耐藥問題亦具有重要的意義。

[1]Garey KW,Rege M,Pai M P,et al.Time to initiation of fluconazole therapy impacts mortality in patients with candidemia:A multi-institutional study[J].Clinical Infectious Diseases,2006,43(1):25.

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[3]Ciardo DE,Ciardo DE,Sch?r A,et al.Internal transcribed spacer sequencing versus biochemical profiling for identification of medically important yeasts[J].Clin Microbiol,2006,44:77.

[4]向華國,熊禮寬,涂植光.幾種提取生殖道常見病原菌DNA方法的比較[J].現代檢驗醫學雜志.2006,21(5):54.

[5]李若瑜.應用現代化診斷方法提高我國真菌病診斷水平[J].中華檢驗醫學雜志,2008,31(2):125.

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