補骨脂素對肝星狀細胞(HSC-T6)增殖、氧化應激及 I型膠原分泌的影響

郭 敏,李佃貴,王建華,高紹芳,張 紈,張紅蓮

1河北醫科大學研究生院,石家莊 050017;2河北醫科大學中醫院消化內科,石家莊 050011;3河北醫科大學天然藥物教研室,石家莊 050017;4石家莊衛生學校,石家莊 050017

補骨脂素對肝星狀細胞(HSC-T6)增殖、氧化應激及 I型膠原分泌的影響

郭 敏1,李佃貴2＊,王建華3,高紹芳4,張 紈1,張紅蓮1

1河北醫科大學研究生院,石家莊 050017;2河北醫科大學中醫院消化內科,石家莊 050011;3河北醫科大學天然藥物教研室,石家莊 050017;4石家莊衛生學校,石家莊 050017

通過研究植物雌激素香豆素補骨脂素對體外培養的大鼠肝星狀細胞 HSC-T6增殖及相關因子表達的影響,為補骨脂素治療肝纖維化提供實驗依據。常規培養肝星狀細胞 HSC-T6,采用 0.1 mmol/L的 H2O2制造HSC-T6氧化應激的模型。分別用MTT法檢測肝星狀細胞增殖、放射免疫法檢測細胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛 (MDA),還原性谷胱甘肽 (GSH),谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)的活性和含量,EL ISA法測定 I型膠原的分泌。結果表明:與正常對照組組比較,補骨脂素在濃度為 10μmol/L,1μmol/L,0.1μmol/L,均呈現出抑制 HSC-T6增殖的作用 (P＜0.05),且最佳作用時間為 48 h(P＜0.05);與模型組比較,補骨脂素各個濃度組能夠提高 SOD和 GSH-Px的活性 (P＜0.05),并降低細胞上清液中MDA和 GSH的含量 (P＜0.05);與模型組比較,補骨脂素各個濃度組在作用 48 h后,細胞上清液中的 I型膠原的表達量均降低 (P＜0.05)。因此,作為植物雌激素的一種,補骨脂素能有效的抑制 HSC-T6的增殖及抗 HSC-T6氧化應激,很可能成為雌激素的替代品在治療肝纖維化中。

肝纖維化;肝星狀細胞;補骨脂素;植物雌激素;氧化應激

Abstract:To investigate the effect of psoralen on the proliferation and correlated factors of hepatic stellate cells(HSCT6)in vitro.Psoralen was dissolved in d imethyl sulphoxide(DMSO)at different concentrations of 10μmmol/L,1 μmmol/L,0.1μmmol/L,and 0.01μmmol/L.The cell proliferation was assessed with methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)after incubation with psoralen for 24 h,48 h,and 72 h,respectively.HSC-T6 were divided into 5 groups and incubated in the presence of 0.1 mol/L hydrogen dioxide followed by washing with PBS for 3 times.Psoralen at different concentrations(10μmol/L,1μmol/L,0.1μmol/L)was added into the cell culture media,and after incubation for 48 h,the activities or levels of superoxide dis mutase(SOD),malonaldehyde(MDA),glutathione(GSH),glutathione peroxidase(GSH-Px),and collagen I(COL I)in the supernatant of the cell culture were measured.The results showed that psoralen inhibited the cell proliferation at the concentration of 10,1,and 0.1μmol/L.Psoralen significantly decreased the production of extracellularMDA,GSH,and COL I and increased SOD and GSH-Px activity.Therefore,psoralen can inhibit the proliferation of HSC-T6,decrease lipid peroxidation in HSC-T6,and degrade the secretion from COL I in HSC-T6.

Key words:liver fibrosis;hepatic stellate cells;psoralen;phytoestrogen;oxidative stress

流行病學調查顯示,患有乙型肝炎的女性患者發展成肝纖維化甚至肝硬化的幾率比男性患者低得多,且多發生在絕經后,育齡期婦女很少有發生肝纖維化或是肝硬化[1]。其機制可能與雌激素和肝臟雌激素受體在不同性別分布及存在差異有關。研究顯示,由四氯化碳 (CCl4)誘導的肝纖維化大鼠經過雌激素治療后,血清透明質酸 (HA)和Ⅳ型膠原(C IV)水平下降,肝臟膠原沉積受到抑制,一型膠原合成較少,平滑肌肌動蛋白 (α-S MA)陽性的 HSC數量降低,從而抑制了大鼠肝纖維化的發生[2]。但是雌激素療法易引起嚴重的副作用,植物雌激素包括黃酮類,香豆素類,木脂素類等,因其化學結構和生物活性與雌激素相似,且沒有雌激素所有的副作用,近年來備受關注。現在研究大都關注黃酮類化合物對肝纖維化的治療作用[3],而同屬于植物雌激素的香豆素類化合物研究甚少。以往研究表明,在治療某些疾病時香豆素類化合物表現出比黃酮類化合物更好的療效[4],推測屬于香豆素類化合物補骨脂素也可能具有與黃酮類相似的抗肝纖維化的作用,在本實驗中初步加以證實。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞

HSC-T6細胞由河北醫科大學中西醫結合研究所惠贈,為活化性永生的大鼠肝星狀細胞系。

1.1.2 儀器與試劑

補骨脂素 (溶于 DMSO備用,由中國藥檢所提供,批號 110739-200309);噻唑藍 (MTT,Sigma公司雙抗,華北制藥廠);DMEM高糖培養基 (G IBCO公司);胎牛血清 FBS(北京燕生科技有限公司);I型膠原 EL ISA試劑盒 (美國 biotech公司);細胞上清液中超氧化物歧化酶 (SOD);丙二醛 (MDA);還原性谷胱甘肽 (GSH);谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)試劑盒 (南京建成生物研究所);CO2培養箱 (美國NATURE);XDS-1B型倒置顯微鏡 (OLY MPUS);TECAN酶標儀 (奧地利)。

1.2 方法

1.2.1 肝星狀細胞 (HSC-T6)的培養及分組

將 HSC-T6細胞從液氮中取出,迅速置于 37℃水浴箱中 1 min內使其融化,無菌條件下打開凍存管,將細胞及其凍存液一起轉入已滅菌的盛有 10 mL 20%FBS-DMEM(高糖)培養基的離心管中,1500 r/min離心 5 min,棄上清,將細胞轉移至 3 mL 20%FBS-DMEM的培養瓶中置于 37℃,5%CO2培養箱中。24 h后進行常規傳代培養。待細胞生長穩定后進行后續試驗。共分為 6組:空白對照組,模型組,補 1(補骨脂素濃度 10μmol/L,P1),補 2(補骨脂素濃度 1μmol/L,P2),補 3(補骨脂素濃度 0.1 μmol/L,P3),補 4(補骨脂素濃度 0.01μmol/L,P4)。

1.2.2 MTT法測補骨脂素對 HSC增殖的影響

取待傳代的 HSC用 10%FBS-DMEM培養基稀釋成 2×104cell/mL接種到 96孔培養板中,每孔200μL,待細胞貼壁后,繼續培養至細胞融合約70%左右,換為不含血清的高糖 DMEM培養基繼續培養,使細胞生長同步化。24 h后更換為用 1%FBSDME M培養基稀釋的補骨脂素 (濃度為 10μmol/L,1 μmol/L,0.1μmol/L,0.01μmol/L),分別在培養 24 h,48 h,72 h后 ,加入 5 mg/mL MTT,20μL/孔 ,于 37 ℃,5%CO2培養箱中培養 4 h,吸棄培養液,加入二甲基亞砜 (DMS O)150μL/孔,震搖溶解 10 min后,用酶標儀測定 492 nm的光吸收度(OD)值。

1.2.3 造模及分組

取待傳代的 HSC-T6用 10%FBS-DMEM培養基稀釋成 2×104/mL密度接種到 96孔培養板中,每孔 200μL,待細胞貼壁后,繼續培養至細胞融合約70%左右,換為不含血清的高糖DMEM培養基繼續培養,使細胞生長同步化。培養細胞用 PBS洗 3遍,用終濃度為 0.1 mmol/L H2O2共同孵育 2 h,用PBS洗 3遍,然后進行分組:(1)模型組,加入 1%FBS-DMEM(無酚紅)培養基培養。(2)補骨脂素組,加入終濃度為 10μmol/L,1μmol/L,0.1μmol/L的補骨脂素孵育。(3)空白對照組,即在未用 0.1 mmol/L H2O2處理過的 HSC-T6中加入加入 1%FBS-DMEM培養基培養。每組設 8個復孔。

1.2.4 SOD、MDA含量和 GSH、GSH-Px活性測定

在分組的基礎上繼續培養 48 h,收集細胞培養基上清液,按照放免試劑盒方法檢測。

1.2.5 EL ISA法檢測 HSC-T6培養上清液中 I型膠原含量

在分組的基礎上繼續培養 48 h,收集細胞培養基上清液,包被于 96孔 EL ISA板,依次加入兔抗大鼠 I型膠原抗體、綿羊抗兔 IgG-HRP、鄰苯二胺,按照試劑盒說明,用酶標儀測定 492 nm的光吸收度(A)值。

1.3 統計學處理

使用 SPSS 13.0 for windows統計軟件,所有數據均以表示,多組間均數比較采用方差分析,均數間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 補骨脂素對 HSC-T6增殖的影響 (表 1)

HSC-T6在不同濃度補骨脂素培養基中培養 24h,只有 10μmol/L有抑制其增殖的作用 (F=33.04,P＜0.01);培養 48 h后,補骨脂素 10μmol/L,1μmol/L和 0.1μmol/L均有明顯抑制 HSC-T6增殖的作用 (F=84.513,P＜0.01),其中 10μmol/L組效果更為明顯 (P＜0.01);培養 72 h后,補骨脂素濃度為 10μmol/L和 1μmol/L組均有抑制 HSCT6增殖的作用 (F=193.892,P＜0.01)。

表1 補骨脂素對 HSC-T6增殖作用的影響 (n=8±s)Table 1 Effect of psoralen on the proliferation of HSC-T6(n=8,±s)

表1 補骨脂素對 HSC-T6增殖作用的影響 (n=8±s)Table 1 Effect of psoralen on the proliferation of HSC-T6(n=8,±s)

注:同空白對照組比較,＊P＜0.01;同補 1組比較,#P＜0.01。Note:compared with control group,＊P＜0.01;compared with P1 group,#P0.01.

組別Group吸光度Absorbency 24 h 48 h 72 h空白對照 0.340±0.021 0.442±0.022#0.529±0.021#補1(P1) 0.229±0.020＊0.240±0.022＊0.325±0.015＊補2(P2) 0.318±0.020 0.328±0.021＊#0.369±0.052＊補3(P3) 0.320±0.022 0.331±0.024＊#0.515±0.022#補4(P4) 0.325±0.024 0.356±0.022＊#0.521±0.021#

2.2 補骨脂素對 HSC-T6的 SOD、GSH、MDA、GSHPx的影響 (表 2)

與空白對照組比較,模型組的 GSH和MDA含量明顯升高,而 SOD和 GSH-Px活性顯著下降 (P＜0.01)。與模型組比較,濃度為 10μmol/L,1μmol/L和 0.1μmol/L補骨脂素治療組能夠不同程度的降低 GSH和 MDA水平,增強 SOD和 GSH-Px活力(P＜0.01),呈明顯的劑量-效應關系。說明 10 μmol/L的補骨脂素能夠使 HSC-T6很好的抵抗由H2O2引起的氧化應激。

表2 補骨脂素對 HSC-T6培養上清液中 GSH、MDA、SOD和 GSH-Px含量的影響 (n=8,±s)Table 2 Effect of psoralen on the content of GSH,MDA,SOD,and GSH-Px in the cell culture supernatant(n=8,±s)

表2 補骨脂素對 HSC-T6培養上清液中 GSH、MDA、SOD和 GSH-Px含量的影響 (n=8,±s)Table 2 Effect of psoralen on the content of GSH,MDA,SOD,and GSH-Px in the cell culture supernatant(n=8,±s)

注:同空白對照組比較,＊P＜0.01;同模型組比較,#P＜0.01。Note:compared with control group,＊P＜0.01;compared withModel group,#P＜0.01.

組別 Group GSH(NU/L) MDA(μmol/L) GSH-Px(KU/L) SOD(μmol/L)空白對照 Control 34.96±2.48# 0.441±0.025# 72.83±2.35# 27.15±1.811#模型組Model 64.08±3.43＊ 0.933±0.022＊ 24.77±3.28＊ 5.80±1.841＊補 1(P1) 42.02±3.16＊# 0.510±0.033＊# 94.43±2.17＊# 23.61±1.961＊#補 2(P2) 45.07±3.68＊# 0.552±0.026＊# 71.48±2.86＊# 14.27±1.868＊#補 3(P3) 54.40±2.91＊# 0.643±0.031＊# 63.19±1.88＊# 10.74±1.415＊#

2.3 補骨脂素對 HSCs培養上清液中 I型膠原蛋白含量的影響 (表 3)

與空白對照組比較,模型組的 I型膠原含量明顯升高 (P＜0.01)。與模型組比較,濃度為 10μmo/L,1μmol/L和 0.1μmol/L補骨脂素治療組能夠不同程度的降低 I型膠原含量 (P＜0.01),呈明顯的劑量-效應關系。

表3 補骨脂素對肝星狀細胞分泌 COL I含量的影響 (n=8,±s)Table 3 The effect of psoralen on the does of COL I in HSC(n=8,±s)

表3 補骨脂素對肝星狀細胞分泌 COL I含量的影響 (n=8,±s)Table 3 The effect of psoralen on the does of COL I in HSC(n=8,±s)

注:同空白對照組比較,＊P＜0.01;同模型組比較,#P＜0.01。Note:compared with control group,＊P＜0.01;compared with model group,#P＜0.01.

組別 Group I型膠原 (ng/mL)空白對照組 Control 133.38±2.394#模型組Model 184.61±2.600＊補 1(P1) 144.33±2.931＊#補 2(P2) 156.73±2.955＊#

3 討論

研究顯示,雌激素及其代謝產物均能夠有效的抑制 HSC增殖和分泌細胞外基質[5],從而具有抗肝纖維化的作用。肝臟中存在雌激素受體,能對雌激素產生反應,從而調節肝臟的功能[8].黃酮類化合物木黃酮[3,6],異黃酮槲皮素[7]均被證明對肝星狀細胞的增殖和功能有明顯的抑制作用,具有抗肝纖維化的作用。而對于香豆素類化合物對肝星狀細胞的作用及是否具有同樣的抗肝纖維化的作用鮮有報道。本實驗研究發現植物雌激素香豆素類化合物補骨脂素能夠抑制體外培養的 HSC-T6的增殖,并呈量效依賴性,尤其是在作用 48 h時效果顯著,提示補骨脂素具有抗肝纖維化作用。

體內在氧應激狀態下產生的自由基可以攻擊細胞膜導致脂質過氧化,使肝細胞損傷和壞死,通過一系列的反應激活 HSC-T6和其他 ECM產生細胞 (包括內皮細胞核肝細胞等),分泌大量的 I型膠原使ECM增多,大量沉積于肝竇間隙,最終導致肝纖維化。由氧自由基引起的氧化應激則是導致肝臟脂質過氧化的中心環節。本實驗用 H2O2與 HSC-T6共培養,誘導氧化應激是較理想的肝纖維化模型。MDA是脂質過氧化的終末產物,可嚴重破壞細胞膜結構,導致細胞腫脹,壞死,其含量高低反映體內自由基過氧化的程度。SOD是超氧陰離子自由基的清除劑,可抑制自由基啟動的脂質過氧化反應,是抑制脂質過氧化反應的重要酶類。GSH與 GSH-Px是一對相互影響的指標,GSH為機體內含量最多的含硫基三肽,對內外刺激性代謝產物有解毒作用,主要被 GSH-Px氧化后對蛋白巰基有保護作用。實驗結果顯示:模型組的 SOD水平下降,MDA含量升高,提示存在明顯的脂質過氧化。與模型組比較,補骨脂素能顯著降低MDA和 GSH含量,提高 SOD活性和 GSH-Px含量,并能夠明顯降低培養液中 I型膠原水平。

提示補骨脂素之所以能夠抑制 HSC-T6增殖,其機制可能與抑制脂質過氧化有關,但是對其在體內試驗是否具有同樣的抗肝纖維化作用需要動物實驗進一步研究證實。另外,由于不同性別的肝細胞中的雌激素受體數量及分布有較大的差異,我們推測補骨脂素有可能是通過作用于肝細胞上的雌激素受體而發揮作用,關于這一推測,我們在后續試驗中將進一步研究證實。

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Effects of Psoralen on the Proliferation and Oxidative Stress of Hepatic Stellate Cell(HSC-T6)and the Secretion of Collagen

IGUO Min1,L IDian-gui2＊,WANG Jian-hua3,GAO Shao-fang4,ZHANGWan1,ZHANG Hong-lian1

1HebeiMedical University Post-graduated College,ShijiaZhuang 050017,China;2Traditional ChineseMedicine Hospital Affiliated to HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang 050011,China;3HebeiMedical University,Laborary of Natural Product Che mistry,Shijiazhuang 050017,China;4Shijiazhuang Health School,Shijiazhuang 050017,China

R285.5

A

1001-6880(2011)01-0035-04

2009-06-15 接受日期:2009-09-08

＊通訊作者 Tel:86-15176947679;E-mail:hbguomin@sina.com